[发明专利]一种用于半胱氨酸特异性检测的荧光化合物及制备方法

说明书

本发明公开一种2‑（咪唑并[1,2‑a]吡啶‑2‑基）苯基丙烯酸酯的荧光化合物，其可以特异性检测生物体内的半胱氨酸；可以选择性的与半胱氨酸作用，该荧光化合物制备过程简单，原料易得，成本低廉，并且具有较好的细胞膜通透性以及较低的细胞毒性，可进入活细胞中并与胞内半胱氨酸迅速发生迈克尔加成反应，产生可肉眼分辨的强烈荧光；通过紫外吸收和荧光分光光度法分析得出该荧光化合物可以在各种干扰物下对半胱氨酸有着优越的选择性，对常见生物分子有着很强的抗干扰能力；本发明化合物结构稳定，可长期保存；不仅可对胞内半胱氨酸选择性识别，而且能在各种活细胞的生长环境下高灵敏度的定量检测半胱氨酸，并应用于活细胞及斑马鱼成像中。

技术领域

本发明属于有机小分子荧光探针领域，尤其涉及以2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯酚为荧光母体的特异性检测半胱氨酸的荧光化学化合物及其应用。

背景技术

半胱氨酸（Cys），高半胱氨酸（Hcy）和谷胱甘肽（GSH）是生物体中涉及和参与各种生理活动的三种氨基硫醇。它们的代谢和转运与体内许多重要酶和蛋白质的功能表达密切相关。因此，体内异常水平的生物硫醇可引起多种疾病。Cys的巯基是酶促反应中的理想亲核试剂，在生理条件下经历可逆的氧化还原反应，这对于形成二硫键同时保持蛋白质的三级和四级结构是必需的。Hcy是蛋氨酸从Cys衍生的关键中间产物，与心血管系统的健康密切相关。GSH参与许多重要的细胞功能活动，如维持细胞内氧化还原稳态，异质代谢，细胞内信号传导和基因调控。由于三种巯基类氨基酸的结构的相似性，区分它们一直是研究的难题。因此，具有高选择性和灵敏度的Cys检测方法对于更清楚地了解其生物学功能的机制具有重要意义，它还可以为多种疾病的预防和诊断提供重要信息，为临床应用提供理论依据。

传统方法用于检测生物硫醇，包括高效液相色谱，质谱和毛细管电泳。这些方法需要高设备成本，样品处理复杂，运行时间长，因此不适合高通量的常规临床试验和科研应用。荧光探针检测方法具有传统仪器检测所不具备的优点。近年来，大量的硫醇检测探针相继被报道。其中大多数探针可以检测活细胞或组织样品中的巯基类化合物，但是只有少数探针可以在巯基类化合物中选择性识别半胱氨酸，因此，开发出一种新型的用于特异性识别细胞和活体组织中半胱氨酸的荧光化合物是我们迫切解决的问题。

丙烯酰酯基团是具有极化α、β不饱和中心的经典迈克尔受体，其可通过迈克尔加成与生物硫醇的巯基发生反应。由于三种生物硫醇的亲核性不同，可以通过不同的加成反应速率和环化裂解过程实现氨基硫醇的选择性鉴定。因为丙烯酰酯基团的选择性和高灵敏度，许多研究人员利用它来实现对生物硫醇的区分。

综上，选择2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯酚作为荧光母体结构，并利用丙烯酰酯基团对2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯酚上羟基进行修饰，猝灭自身的荧光，提高其灵敏度，有望开发出能够特异性识别半胱氨酸并可应用于细胞和活体组织成像的新型荧光化合物。

发明内容

本发明第一个目的是开发出一种可选择性检测生物硫醇的荧光化合物，该荧光化合物可区分半胱氨酸与同型半胱氨酸和谷胱甘肽。

本发明第二个目的是提供一种可选择性检测生物硫醇的荧光化合物的制备方法。

本发明第三个目的是提供一种可应用于溶液、生物组织及细胞中半胱氨酸检测的方法。

一种用于半胱氨酸特异性检测的荧光化合物为2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯基丙烯酸酯，其化学结构式如式（І）所示：

式（І）。

一种用于半胱氨酸特异性检测的荧光化合物的制备方法，操作步骤如下：

（1）由1-（2-羟基苯基）乙酮、吡啶-2-胺和碘反应制备得到2-（咪唑并[1,2-a]吡啶-2-基）苯酚（HPIP）；