[发明专利]一种利用TRAP分子标记技术鉴定东北林蛙遗传性别的方法

权利要求书

1.一种鉴定东北林蛙遗传性别的分子标记的应用，其特征是按以下步骤操作： （1）提取东北林蛙脚趾组织的基因组DNA， （2）以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增反应，PCR扩增反应所用上游引物为SEQ ID NO :1所示序列，即5’-GGTCATTCCTTGTCCTAATTATCAGT-3’，下游引物为SEQ ID NO :2所示序列，即5’-GACTGCGTACGAATTGAG-3’； （3）用14%的聚丙烯酰胺凝胶对PCR扩增产物进行电泳检测，结果具有SEQ ID NO :3所 示核苷酸序列对应的261bp条带的个体为遗传雄性东北林蛙，缺失SEQ ID NO :3所示核苷酸序列对应条带的个体为遗传雌性东北林蛙； （4）对遗传雄性特异性条带进行回收纯化、测序，确定其为东北林蛙性别特异性分子标记，即SEQ ID NO :3，所述分子标记表现为SEQ ID NO :3 所示核苷酸序列， GGTCATTCCTTGTCCTAATTATCAGTTGCAGAATATTTAATAAATATATGCAGAGTTCCAAATGGATTTTAAT AGACCTTGTTTTAGTCTAGTTCCACGTGGCTGATTTTTGCGGTATGCCCAAATTAGCAACCCAGGTGTAAAGAAGTC CTGCTGGGATTGGTTTATTTCTGCTGAGTTGTAAAAGAAGTAGCTGACAACAGGACTGTGTAAGACCAATCTCGATC ACTTGGGCTTCTCTTTCTCAATTCGTACGCAGTC 具有SEQ ID NO :3所示核苷酸序列的个体，表现为遗传雄性东北林蛙，缺失SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的个体为遗传雌性东北林蛙。

2.根据权利要求1所述的一种鉴定东北林蛙遗传性别的分子标记的应用，其特征是，分析PCR扩增产物时，电泳电压为120V，电泳时间为10 ~ 14h。

3.根据权利要求1所述的一种鉴定东北林蛙遗传性别的分子标记的应用，其特征是，扩增时，反应体系为10μl，包括10×Buffer 1 μ l，dNTP 0 .2μl , Taq聚合酶0 .1μl，灭菌去离子水7 .1μl，上游引物0 .4μl、下游引物0 .4μl，模板0 .8μl。

4.根据权利要求1所述的一种鉴定东北林蛙遗传性别的分子标记的应用，其特征是，扩增时，反应条件为：94℃ 4 min，1个循环；94℃ 1 min，35℃ 1 min，72℃ 1 min，5个循环；94℃ 1 min，51℃ 1 min，72℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 7 min ,1个循环，4℃保存。

5.如权利要求1所述的一种鉴定东北林蛙遗传性别的分子标记的应用，其特征是，用于制备鉴定待测东北林蛙的遗传性别的试剂盒。

6.根据权利要求1所述的一种鉴定东北林蛙遗传性别的分子标记的应用，其特征是，所述应用为利用SEQ ID NO :3 所示的分子标记确定待测东北林蛙的遗传性别，获得伪雄个体作为父本与正常雌性抱对排卵，获得高雌性比例的子代。