[发明专利]一种利用TRAP分子标记技术鉴定东北林蛙遗传性别的方法

说明书

一种鉴定东北林蛙遗传性别的分子标记及其应用，它涉及分子标记领域。为了解决目前无法对东北林蛙遗传性别进行鉴定的问题，本发明提取东北林蛙脚趾组织的基因组，以提取的基因组DNA为模板，以含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列的引物对进行PCR扩增反应。通过14%的聚丙烯酰胺凝胶对PCR扩增产物进行电泳检测，扩增结果具有SEQ ID NO:3所示核苷酸序列（261 bp）对应条带的个体为遗传雄性东北林蛙，缺失SEQ ID NO:3所示核苷酸序列对应条带的个体为遗传雌性东北林蛙。该发明可鉴定伪雄个体，即生理为雄性，但遗传为雌性的个体。利用伪雄个体与雌性个体交配，产生的后代，生理雌性比例高达90%以上。能实现对东北林蛙养殖群体性别控制，提高东北林蛙养殖的经济效益。

技术领域

本发明涉及分子标记领域，具体涉及一种鉴定东北林蛙遗传性别的分子标记及其应用。

背景技术

东北林蛙（ Rana Dybowskii）隶属于两栖纲（Amphibian）无尾目（Anura）蛙科（Ranidae）蛙属（ Rana），主要分布在我国东三省及内蒙古部分地区，是我国东北地区重要经济动物之一。东北林蛙的经济价值主要体现在雌蛙输卵管。《中国药典》记载，东北林蛙输卵管经干燥可制得林蛙油，林蛙油性甘、咸、平，归肺、肾经，具有补肾益精，养阴润肺的功效，用于病后体弱，神疲乏力，心悸失眠，盗汗，痨嗽咳血。

进入20世纪90年代后，林蛙的人工养殖进入了一个高速发展时期，而且国内林蛙养殖80%以上集中在吉林、黑龙江、辽宁三省，因此林蛙养殖在振兴东北经济中具有重要地位。据统计，仅吉林省每年林蛙养殖量达几十亿只，年回捕商品林蛙3亿只左右，生产林蛙油160吨左右，2010年产值达到15亿元。

在东北林蛙养殖过程中，养殖群体雄性比例过高这一问题严重影响了东北林蛙养殖的经济效益。东北林蛙性别分化由遗传因素决定，同时受环境因素修饰，并在变态结束前完成，此后个体生理性别不再改变。由于环境因素对东北林蛙性别分化具有修饰作用，因此东北林蛙会出现遗传性别与生理性别不一致的个体，即性逆转个体。动物的性逆转个体在单性育种中具有非常重要的作用，已经成功运用于全雄罗非鱼和高雌半滑舌鳎等鱼类的单性生产中。东北林蛙的生理性别可以通过外部形态观察得以鉴定，但由于东北林蛙核型分析中未能观察到异型性染色体，所以无法对东北林蛙遗传性别进行鉴定，从而无法成功获得性逆转个体。

性别特异性DNA分子标记是物种遗传性别鉴定有效载体。因此，获取一种能够鉴定东北林蛙遗传性别的DNA分子标记是构建全雌或高雌养殖群体的关键技术之一。然而，目前尚未见东北林蛙性别特异性DNA分子标记的报道。

发明内容

本发明的目的是针对上述技术中存在的问题，提供了一种鉴定东北林蛙遗传性别的DNA分子标记及鉴定方法。利用本发明的技术方案，可以确定东北林蛙的遗传性别。

本发明的目的是这样实现的，其特征是，按以下步骤操作：

（1）提取东北林蛙脚趾组织的基因组DNA，

（2）以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增反应，PCR扩增反应所用上游引物为SEQ ID NO :1所示序列，即5’-GGTCATTCCTTGTCCTAATTATCAGT-3’，下游引物为SEQ ID NO :2所示序列，即5’- GACTGCGTACGAATTGAG-3’。

（3）用14%的聚丙烯酰胺凝胶对PCR扩增产物进行电泳检测，结果具有SEQ ID NO :3所示核苷酸序列对应条带，即图2所示的方框内条带，的个体为遗传雄性东北林蛙，缺失SEQ ID NO :3所示核苷酸序列对应条带的个体为遗传雌性东北林蛙。