[发明专利]基于RPA技术检测胡萝卜种子中的马铃薯斑纹片病菌的方法及试剂盒

说明书

本发明提供了基于RPA技术的检测胡萝卜种子中的马铃薯斑纹片病菌的试剂盒及方法，该试剂盒及方法特异性好、灵敏度高、检测时间短和不需要特殊的仪器即可针对胡萝卜种子中的马铃薯斑纹片病菌进行检测，检测低限为12.22copies/μL，对Lso早期诊断和基层单位初筛实验室的快速检测存在一定的优越性，同时对进出境相关植物及产品检验检疫具有指导意义。

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别涉及基于RPA技术检测胡萝卜种子中的马铃薯斑纹片病菌的方法及试剂盒。

背景技术

马铃薯斑纹片病菌(Candidatus Liberibacter solanacearum，简称 Lso），自1994年在墨西哥首次报道以来，目前该病菌已在全世界范围内蔓延，已在北美洲、中美洲、欧洲、大洋洲、非洲和亚洲等十几个国家发生。Lso以马铃薯木虱（Bactericeracockerelli）、胡萝卜木虱（Trioia apicalis）、Bactericera trigonica和茄子木虱（Acinia solanicola）为媒介进行田间扩散传播，通过种薯、嫁接苗和带菌种子进行远距离传播。Lso天然寄主不仅是马铃薯，而且侵染其他茄科作物如番茄、辣椒等，以及胡萝卜、芹菜等伞形科作物，引起寄主矮化，叶片褪绿发紫，节间缩短变粗膨大，果实畸形，发育停滞或不结果，导致作物严重减产，构成巨大经济损失。

2004年，欧洲和地中海植物保护组织（EPPO）将马铃薯斑纹片病菌及其媒介昆虫马铃薯木虱列为A1类检疫性有害生物。Lso同柑橘黄龙病一样，可防可控不可治，有效的控制方法很大程度上依赖于早发现早处理。2017年8月以来，我国口岸多次从进境种子中截获该病菌。

Ravindran等开发了基于Lso的16S-23S rRNA基因的普通PCR检测方法，根据其反应条件，PCR检测时间长达2h 左右。Liefting 等基于Lso的16S rRNA基因开发了巢式PCR检测方法。该方法需要两轮PCR扩增，耗时长，操作繁琐，容易发生污染。Wenbin等采用多重荧光 PCR建立Lso的检测方法，该方法检测时长约1.5h, 且需要较为昂贵的仪器—实时荧光定量PCR仪。Ravindran 等于建立了 LAMP 技术用于检测Lso，基于16S rRNA 序列的6个独立区域设计了 LAMP 引物，可直接通过在扩增过程中形成不溶性的焦磷酸镁沉淀进行结果判断。该方法检测时长60min，且设计6条具有高特异性的引物难度较大。

综上，加强Lso早期诊断，探索快速、准确、高灵敏度、高特异性的检测技术对防止该病害的传播蔓延具有极其重要的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种灵敏、准确、简便和快速的基于RPA技术的检测胡萝卜种子中的马铃薯斑纹片病菌的方法，本发明还提供了用于该方法的特异性好、灵敏度高、检测时间短和不需要特殊的仪器的针对胡萝卜种子中的马铃薯斑纹片病菌的RPA检测试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

本发明提供了一种检测或辅助检测胡萝卜种子中的马铃薯斑纹片病菌的方法，所述的方法包括如下步骤：

1）DNA提取

采用植物基因组DNA 提取试剂盒从待测胡萝卜种子中提取DNA；

2）RPA扩增

以提取的DNA为模板，采用由SEQ ID NO ：11所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列组成的引物对进行RPA扩增；

RPA扩增体系的配制方法如下：10μM/μL的引物各2.4μL，再水化缓冲液29.5μL，将以上体系混匀移入含有冻干酶粉的 0.2 mL 反应管中，再加入50ng DNA模板，加入2.5μL280 mmol/L醋酸镁溶液，去离子水补足至50 μL；所述RPA扩增的温度为40℃，时间为40min；