[发明专利]一种EGFR基因突变检测试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种EGFR基因突变检测试剂盒及其应用，该试剂盒包括PCR反应液、引物探针混合液、阳性质控品和阴性质控品，所述引物探针混合液包括四组分别用于检测EGFR基因18、19、20、21号外显子突变的特异性正反向引物、荧光探针和锁核酸探针，检测范围广。本发明结合锁核酸技术和荧光定量PCR技术检测EGFR基因上多种突变，整个过程闭管操作，简便快捷，同时大大降低污染几率，特异性强，灵敏度高，有助于高效筛选恶性肿瘤免疫治疗和靶向治疗的检测对象，为临床用药提供理论依据。

技术领域

本发明涉及基因检测领域，尤其涉及一种EGFR基因突变检测试剂盒及其应用。

背景技术

肺癌位居全球总人口癌症致死率排行之首，占癌症总患者的18.4％。根据肺癌的生物学特性，可分为小细胞肺癌(Small Cell Lung Cancer，SCLC)和非小细胞肺癌(NonSmall Cell Lung Cancer，NSCLC)两大类，其中NSCLC约占80％-85％。大多数肺癌患者在确诊时已为晚期，治疗难度大，病死率高。随着分子生物学和精准医疗的飞速发展，肿瘤药物治疗已从传统的放化疗发展到分子靶向治疗。近年来，表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂治疗晚期非小细胞肺癌患者已成熟应用于临床，能显著改善患者的生活质量，延长患者生存期，治疗效果更持久。

人类表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor，EGFR)是一种蛋白酪氨酸激酶受体，广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，EGFR信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用。EGFR基因位于人类7号染色体，包含28个外显子，其酪氨酸激酶编码区为18～24号外显子。EGFR定位于细胞膜，通过RAS/RAF/MEK/MAPK、PI3K/AKT/mTOR途径传进细胞核。当该通路的信号传导异常时，EGFR突变引发自身磷酸化，激活酪氨酸激酶，并进一步激活下游信号通路，促进肿瘤的发生。EGFR基因突变常集中在细胞内的酪氨酸激酶区域，主要集中在18～21号外显子上。因此，建立快速检测EGFR基因突变状态有助于高效筛选免疫治疗和靶向治疗的检测对象，为临床用药提供理论依据。

目前，直接测序法一直以来是检测基因突变的金标准，但是DNA直接测序法存在很多缺点：操作耗时长，后续要对PCR产物进行处理，过程复杂，容易出现污染导致结果不准确；并且灵敏度低，尤其在混合模板时检出率低，一般需要突变基因丰度达到20％以上才能准确检测。

发明内容

有鉴于此，本发明提出了一种检测范围广、灵敏度和准确度高的EGFR基因突变检测试剂盒及其应用。

本发明的技术方案是这样实现的：

第一方面，本发明提供了一种EGFR基因突变检测试剂盒，PCR反应液、引物探针组合物、阳性质控品和阴性质控品，其特征在于：所述引物探针混合液包括正向引物1-4和反向引物1-4，所述正向引物1-4的序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.9、SEQID NO.14所示，所述反向引物1-4的序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.15所示。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述引物探针混合液还包括荧光探针1-4，所述荧光探针1-4的序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.16所示，其5’端均标记有荧光基团，3’端均标记有能够淬灭相应5’端荧光基团所发射荧光信号的淬灭基团。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述引物探针混合液还包括锁核酸探针1-5，所述锁核酸探针1-5的序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.12、SEQ IDNO.13、SEQ ID NO.17所示，其3’端均连接有PO4基团。