[发明专利]一种制备永生化树突状细胞的基因、载体、方法和永生化树突状细胞

说明书

本发明提供了一种制备永生化树突状细胞的基因、载体、方法和永生化树突状细胞，属于基因工程技术领域，将ST40基因经linker与TAX2基因连接后，得到制备永生化树突状细胞的基因；所述ST40基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述TAX2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。采用本发明提供的基因制备得到的永生化树突状细胞，除包括HLA‑A0201以外，还涵盖了中国人群常见的HLA‑A1101、HLA‑A2402、HLA‑A0301等近9种类型，大大增加了应用范围。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种制备永生化树突状细胞的基因、载体、方法和永生化树突状细胞。

背景技术

以T淋巴细胞为主体的过继细胞治疗在抗肿瘤免疫治疗中的作用日益显著，如何获得足够数量的抗原特异性T细胞成为目前最重要的技术难点。传统的特异性T淋巴细胞的扩增方式主要是抗原肽和患者的PBMC共培养，其主要依赖于PBMC天然存在的抗原提呈细胞，特别是DC的提呈，进而活化T细胞；天然DC在体外培养存活时间短，在患者PBMC中所占的比例低，提呈能力有限。目前存在的永生化DC技术，虽然能解决上述提呈能力低的问题，但是仅适用于HLA-0201的患者，应用范围有限。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种制备永生化树突状细胞的基因、载体、方法和永生化树突状细胞，将本发明提供的基因插入原始载体，构建制备永生化树突状细胞的载体，所述载体增加了构建永生化树突状细胞的成功率，进而增加了HLA的应用范围。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种制备永生化树突状细胞的基因，将ST40基因经linker与TAX2基因连接后，得到制备永生化树突状细胞的基因；

所述ST40基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述TAX2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

优选的，所述linker的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

本发明还提供了一种制备永生化树突状细胞的载体，将上述技术方案所述的基因插入原始载体中，得到制备永生化树突状细胞的载体。

优选的，所述原始载体包括pCDH MSCV和/或pCDH-CMV。

本发明提供了一种制备永生化树突状细胞的方法，包括以下步骤：

1)将上述技术方案所述的载体包装慢病毒，得到包装病毒，将所述包装病毒感染树突状细胞，得到感染树突状细胞；

2)将滋养细胞接种于细胞培养器的上层培养室，将所述步骤1)得到的感染树突状细胞接种于细胞培养器的下层培养室，培养4～6周，除去CD3+细胞后继续培养1～2周，除去CD3+细胞后继续培养2个月以上，得到永生化树突状细胞。

优选的，所述步骤2)滋养细胞的制备包括：将外周血单个核细胞在含有质量百分含量为10％的FBS的1640培养基中培养过夜，得到滋养细胞。

优选的，所述步骤1)树突状细胞来源于外周血单个核细胞。

优选的，所述步骤1)滋养细胞的接种量为0.5～1.5×10⁶个/孔，所述感染树突状细胞的接种量为0.5～1.5×10⁶个/孔。

本发明还提供了上述技术方案所述的方法制备得到的永生化树突状细胞，所述永生化树突状细胞的表型包括：CD3-、CD4+、CD8-、CD16-、CD19-、CD56-、CD11c+、CD11b-、CD58+、CD40+、CD70+、CD80+、CD83+、CD86+、TCR-、CD11b-、CD197-、CD303-、CD1c-、CD205+、CD141和CD123+。