[发明专利]一种胎盘间充质干细胞外泌体的制备和储存方法

权利要求书

1.一种胎盘间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

培养：将P3代胎盘间充质干细胞接种在干细胞培养基中培养、待融合度达到80-90％后将其吸出培养基，更换DMEM培养基培养24h，收集上清液，去除细胞碎片，得到包含外泌体的溶液；

纯化：取上述包含外泌体的溶液，通过0.22μm无菌过滤膜过滤后取滤液，随后将滤液置于10000-20000r/min转速下离心50-90min，离心后取上清液通过0.22μm无菌过滤膜过滤，用生理盐水重悬，并于10000-20000r/min离心50-90min，所得上清液即为外泌体。

2.根据权利要求1所述的胎盘间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，干细胞培养基包括：2％FBS，终浓度为40ng/mL的维生素C10ng/mL的bEGF。

3.根据权利要求1所述的胎盘间充质干细胞外泌体的制备和储存方法，其特征在于，将P3代细胞接种于干细胞培养基后，置于37℃、5％CO₂的恒温培养箱中培养。

4.根据权利要求1所述的胎盘间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，上述去除细胞碎片的方法包括：第一次离心，以1800-5000r/min转速离心25min，取上清液进行第二次离心；第二次离心，以8000-10000r/min转速离心30min，保留上清液，即为包含外泌体的溶液。

5.根据权利要求1所述的胎盘间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述P3代胎盘间充质干细胞可以通过以下方法获得：

1)胎盘预处理：将采取得到的组织加入清洗液清洗至无血液残留，离心保留沉淀，即获得干净的胎盘组织；

2)胎盘组织消化：将上述胎盘组织剪成小块，并加入组织消化液消化，获得分离的胎盘间充质干细胞；

3)胎盘间充质干细胞的原代培养：在上述胎盘间充质干细胞中加入细胞培养液培养，即P0代培养，每隔3天半量换含青霉素和链霉素的完全培养液一次；

4)胎盘间充质干细胞的传代培养：待原代培养至第15天、且细胞融合度达到80-90％时，完全弃掉培养液，清洗细胞并加入传代培养消化液消化，消化结束后加入完全培养液终止消化，再分装培养直至获得P3代胎盘间充质干细胞。

6.根据权利要求5所述的胎盘间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中的清洗液包括：生理盐水，终浓度为10ug/mL的硫酸庆大霉素，10ug/mL的两性霉素B和总体积的50％的红细胞裂解液。

7.根据权利要求5所述的胎盘间充质干细胞外泌体的制备和储存方法，其特征在于，所述步骤2)中的组织消化液包括：含青霉素和链霉素的DMEM培养基，50％Tryple酶和终浓度为0.6-0.7mg/mL的I型胶原酶。

8.根据权利要求5所述的胎盘间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中的传代培养消化液包括：0.25％的胰蛋白酶和0.004％的EDTA。

9.一种胎盘间充质干细胞外泌体的储存方法，其特征在于，包括以下步骤：

取权利要求1-8任一项的制备方法制备得到的外泌体，向所述外泌体中加入等体积的冻存液，其中冻存液包括SR无血清培养基、甘油和维生素C，放入-80℃低温冰箱冰冻24h，再取出放入-196℃液氮中冻存。

10.根据权利要求9所述的胎盘间充质干细胞外泌体的储存方法，其特征在于，所述冻存液包括：20％SR无血清培养基，25-30％甘油和15％维生素C。