[发明专利]一种胎盘间充质干细胞外泌体的制备和储存方法

说明书

本发明涉及胎盘间充质干细胞外泌体的制备和储存方法，属于干细胞与再生医学技术领域。该方法，包括以下步骤：将P3代胎盘间充质干细胞培养、待融合度达到80‑90％后将其吸出培养基，更换DMEM培养基培养24h后收集上清液，去除细胞碎片，再通过0.22μm无菌过滤膜过滤，取滤液在13000r/min转速下离心60min，上清液通过0.22μm无菌过滤膜过滤，即得到高纯度外泌体，最后用生理盐水重悬并13000r/min离心65min，获得浓缩的外泌体；外泌体加入含SR无血清培养基、甘油和维生素C的冻存液，‑80℃冰冻24h后取出，再放入‑196℃液氮中冻存。上述胎盘间充质干细胞外泌体的制备方法，针对常规技术中的不足，通过调整提取方法和改良冻存液，取得高纯度、高密度且能保持活性的外泌体。

技术领域

本发明涉及干细胞与再生医学技术领域，特别是涉及一种胎盘间充质干细胞外泌体的制备和储存方法。

背景技术

间充质干细胞(MSC)是一类来源于中胚层的具有高度更新和多向分化潜能的多能干细胞，可以在体外培养扩增并在特定的条件下分化为脂肪细胞、骨细胞、肝脏细胞等组织细胞。因此，间充质干细胞在临床上被广泛应用于细胞移植治疗中。但是有研究表明，干细胞移植后的增值率很低，并不能代替整个组织，细胞移植治疗的主要机制很可能为干细胞的外泌体促进组织修复而不是简单的细胞代替。

外泌体是由活细胞分泌的直径30-150nm、包含了复杂的RNA和蛋白质的双层脂膜囊泡状结构。间充质干细胞的外泌体内包含多种趋化因子、细胞因子以及生长因子的转录因子等，不仅可以招募血管内皮细胞、促进其增殖和迁移来促进血管再生，以改善宿主血供，进而促进组织损伤修复；还可以刺激宿主内源性细胞，激活其活性，从而改善组织环境、增强内源性修复系统。

胎盘属于医疗废弃物，是胎儿出生后排出母体的产后废弃物，简单易得。胎盘间充质干细胞(placenta-derived mesenchymal stem cells,PMSCs)来源于胎盘绒毛膜。与其他来源的间充质干细胞相比，胎盘间充质干细胞的获取简单，且具有更强的增殖能力强，还能分泌更多的免疫调节因子。另外，间充质干细胞发挥作用的关键分子CD105在胎盘间充质干细胞中的含量更高。并且，胎盘间充质干细胞在体内向损伤组织迁移的能力更强，且具有更强的促进血管新生的能力。

由此，将胎盘来源的间充质干细胞进行分离、培养和纯化，并进一步获取其外泌体，能够一定程度上提高干细胞临床应用的成功率。然而，传统的对胎盘间充质干细胞外泌体的分离提取方法中最常用的为超速离心法，采用低速、高速离心交替进行，但该手段比较费时、回收率不稳定、外泌体的纯度受多种因素影响；另外，重复高速离心还可能对囊泡造成伤害，进而影响外泌体的纯度。

发明内容

基于此，有必要针对上述问题，提供一种胎盘间充质干细胞外泌体的制备和储存方法，

一种胎盘间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：

培养：将P3代胎盘间充质干细胞接种在干细胞培养基中培养、待融合度达到80-90％后将其吸出培养基，更换DMEM培养基培养24h，收集上清液，去除细胞碎片，得到包含外泌体的溶液；

纯化：取上述包含外泌体的溶液，通过0.22μm无菌过滤膜过滤后取滤液，随后将滤液置于10000-20000r/min转速下离心50-90min，离心后取上清液通过0.22μm无菌过滤膜过滤，用生理盐水重悬，并于10000-20000r/min离心50-90min，所得上清液即为外泌体。

上述胎盘间充质干细胞外泌体的制备方法，针对常规技术中提取时间长、提取纯度不高的不足，通过调整提取方法，在较短时间内取得高纯度、高密度的外泌体。

具体的，去除细胞碎片后的间充质干细胞在10000-20000r/min转速下离心50-90min获得高纯度外泌体，再进一步离心纯化浓缩，得到总蛋白浓度高的外泌体。