[发明专利]一种通过共表达血红蛋白来提高毕赤酵母工程菌中α-半乳糖苷酶甲醇诱导表达量的方法

权利要求书

1.一种通过共表达血红蛋白来提高毕赤酵母工程菌中α-半乳糖苷酶甲醇诱导表达量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）、构建表达质粒pPIC9K- Gal1：用DNA限制性内切酶EcoRⅠ/NotⅠ对α-半乳糖苷酶基因Gal1和毕赤酵母甲醇诱导型表达载体pPIC9K同时进行双酶切，之后用T4 DNA连接酶将α-半乳糖苷酶基因连接进载体pPIC9K中，形成表达质粒pPIC9K- Gal1；

所述α-半乳糖苷酶基因为在密码子、mRNA二级结构和GC含量方面进行优化后的米根毛霉（Rhizomucor miehei）来源的一个α-半乳糖苷酶基因；

（2）、构建甲醇诱导型表达α-半乳糖苷酶的毕赤酵母工程菌出发菌株：按照Invitrogen公司的酵母转化方法将质粒pPIC9K- Gal1转化到毕赤酵母GS115感受态细胞中，涂布在MD平板上，30℃培养4天，用无菌水吹取MD平板表面的克隆涂布于含有4 mg/mL G418的YPD平板上，30℃培养5天，挑选阳性克隆作为出发菌株；

所述的质粒pPIC9K- Gal1为经DNA限制性内切酶PmeⅠ酶切过的质粒；

（3）、构建共表达质粒pPICZαA-PVT- Gal1：以与步骤（1）同样的方法构建毕赤酵母表达质粒pPICZαA- Gal1，用DNA限制性内切酶BamHⅠ酶切基因片段PVT以及毕赤酵母表达质粒pPICZαA- Gal1，之后用T4 DNA连接酶将PVT连接进表达质粒pPICZαA- Gal1中，形成共表达质粒pPICZαA-PVT- Gal1；

所述基因片段PVT为将透明颤菌血红蛋白基因vgb置于树干毕赤酵母低氧诱导启动子PsADH2及终止子之间形成的DNA片段；

（4）、构建共表达毕赤酵母工程菌株：按照Invitrogen公司的酵母转化方法，将第（2）步得到的出发菌株制作成感受态细胞，将共表达质粒pPICZαA-PVT- Gal1电转化至其中，涂布在含100 μg/mL博来霉素 的YPDS平板上筛选阳性克隆，得到共表达毕赤酵母工程菌株；

所述共表达质粒pPICZαA-PVT- Gal1为经DNA限制性内切酶PmeⅠ酶切后的质粒。