[发明专利]一种通过共表达血红蛋白来提高毕赤酵母工程菌中α-半乳糖苷酶甲醇诱导表达量的方法

说明书

本发明涉及通过共表达血红蛋白来提高毕赤酵母工程菌中α‑半乳糖苷酶甲醇诱导表达量的方法，可有效解决提高毕赤酵母工程菌中α‑半乳糖苷酶甲醇诱导表达量及其应用的问题，方法是，构建表达质粒pPIC9K‑Gal1；构建甲醇诱导型表达α‑半乳糖苷酶的毕赤酵母工程菌出发菌株，构建共表达质粒pPICZαA‑PVT‑Gal1，将出发菌株制作成感受态细胞，将共表达质粒pPICZαA‑PVT‑Gal1电转化至其中，涂布在含100μg/mL博来霉素的YPDS平板上筛选阳性克隆，得到共表达毕赤酵母工程菌株；本发明制备方法简单，新颖独特，易操作，表达效果好。

技术领域

本发明涉及化工，特别是一种通过共表达血红蛋白来提高毕赤酵母工程菌中α-半乳糖苷酶甲醇诱导表达量的方法。

背景技术

α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.12)能够将α-半乳寡糖、半乳甘露聚糖侧链、半乳糖脂和糖蛋白通过α-半乳糖苷键连接的非还原端的半乳糖苷残基逐个水解掉。α-半乳糖苷酶在食品、饲料等工业中有着广泛的应用。在制糖工业中，α-半乳糖苷酶可以分解甜菜浆中的棉籽糖来提高蔗糖的回收率。在饲料工业中，α-半乳糖苷酶可以分解饲料中的棉籽糖家族寡糖类抗营养物质，减少其在单胃动物饲喂中引起的腹胀和腹泻问题，同时又能提高饲料的利用率。在造纸工业中，α-半乳糖苷酶还可以用来提高甘露聚糖酶对纸浆的漂白效果。所以α-半乳糖苷酶有着广阔的市场前景。在生产方面，利用基因工程的手段构建高效的表达菌株是现在α-半乳糖苷酶生产的主要途径，毕赤酵母就是一种最常用的工程菌株，为了提高毕赤酵母工程菌株中α-半乳糖苷酶的表达量，通过在甲醇诱导型分泌表达α-半乳糖苷酶的毕赤酵母工程菌株中共表达透明颤菌血红蛋白的方法来提高毕赤酵母工程菌株发酵液中α-半乳糖苷酶的表达量，具有显著的提高效果，相对于出发菌株，共表达透明颤菌的血红蛋白将α-半乳糖苷酶的表达量提高，但至今未见有公开报导。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种通过共表达血红蛋白来提高毕赤酵母工程菌中α-半乳糖苷酶甲醇诱导表达量的方法，可有效解决提高毕赤酵母工程菌中α-半乳糖苷酶甲醇诱导表达量及其应用的问题。

本发明解决的技术方案是，一种通过共表达血红蛋白来提高毕赤酵母工程菌中α-半乳糖苷酶甲醇诱导表达量的方法，包括以下步骤：

（1）、构建表达质粒pPIC9K- Gal1：用DNA限制性内切酶EcoRⅠ/NotⅠ对α-半乳糖苷酶基因Gal1和毕赤酵母甲醇诱导型表达载体pPIC9K同时进行双酶切，之后用T4 DNA连接酶将α-半乳糖苷酶基因连接进载体pPIC9K中，形成表达质粒pPIC9K- Gal1；

所述α-半乳糖苷酶基因为在密码子、mRNA二级结构和GC含量方面进行优化后的米根毛霉（Rhizomucor miehei）来源的一个α-半乳糖苷酶基因；