[发明专利]rhPTH(1-34)蛋白原液的纯化方法

权利要求书

1.一种rhPTH(1-34)蛋白原液的纯化方法，包括菌体破碎、镍离子螯合亲和层析、融合蛋白酶切、阴离子交换层析、反相层析以及阳离子交换层析的步骤，其特征在于，所述菌体破碎具体包括：取表达有rhPTH(1-34)蛋白的菌体，用缓冲液A重新悬浮，高压匀浆机破菌，破菌液离心，收集上清液，0.45μm滤芯过滤，收集滤过液，所述缓冲液A由磷酸盐缓冲液、NaCl、咪唑和水组成，其中，磷酸盐缓冲液的浓度为10mmol/L、NaCl的浓度为500mmol/L，咪唑的浓度为50～60mmol/L，所述缓冲液A的pH＝8.0；

所述镍离子螯合亲和层析具体包括：用所述缓冲液A平衡的镍离子螯合亲和层析柱，以1.40～1.80g湿菌/ml填料的上样量上样至所述镍离子螯合亲和层析柱，采用所述缓冲液A淋洗，用缓冲液B洗脱，得到融合蛋白样品；超滤，置换液为缓冲液C；

所述缓冲液B由磷酸盐缓冲液、咪唑和水组成，其中，磷酸盐缓冲液的浓度为10mmol/L、咪唑的浓度为100～150mmol/L，所述缓冲液B的pH＝8.0；

所述融合蛋白酶切具体包括：用50mmol/L Tris-HCl、1mmol/L CaCl₂，pH＝8.0的缓冲液将超滤后的融合蛋白稀释至1mg/ml，按1U肠激酶：6～8mg融合蛋白的酶解比例，在25℃的恒温摇床内酶切20小时；

所述反相层析具体包括：选用反相层析柱Source 15RPC，上样量7～10mg蛋白/ml填料，以缓冲液F作为流动相A，以缓冲液G作为流动相B，所述流动相A平衡所述反相层析柱，上样后再用所述流动相A淋洗，先用40％的所述流动相B洗涤杂质，再用40％～60％所述流动相B连续梯度洗脱目的蛋白，得到的目的蛋白，所述目的蛋白经缓冲液H稀释后进行阳离子交换层析，洗脱的得到纯化后的目的蛋白；

所述阳离子交换层析具体包括：所述反相层析获得的目的蛋白稀释液上样于用所述缓冲液H平衡的阳离子交换层析柱，上样后用所述缓冲液H淋洗后，先用由10mmol/L磷酸缓冲液和50mmol/L NaCl组成的pH＝7.0的缓冲液洗涤杂质，再用由10mmol/L磷酸缓冲液和10～210mmol/L NaCl组成的pH＝7.0的缓冲液洗脱，收集目的蛋白，即为所述rhPTH(1-34)蛋白原液；

所述缓冲液C为10mmol/L Tris-HCl，pH＝8.0；

所述阴离子交换层析具体包括：将酶切后的酶解蛋白上样于用缓冲液D平衡的阴离子交换层析柱，收集穿透液，其中，所述缓冲液D由Tris-HCl、CaCl₂和水组成，其中，Tris-HCl的浓度为50mmol/L、CaCl₂的浓度为1mmol/L，所述缓冲液D的pH＝8.0；

所述缓冲液F由磷酸缓冲液、乙醇和水组成，其中，所述磷酸缓冲液的浓度为10mmol/L，所述乙醇的浓度为10％，所述缓冲液F的pH＝8.0；

所述缓冲液G为80％乙醇，所述流动相B的梯度体积为20CV；所述缓冲液H为10mmol/L的磷酸缓冲液，所述缓冲液H的pH＝6.0。