[发明专利]rhPTH(1-34)蛋白原液的纯化方法

说明书

本发明公开了一种rhPTH(1‑34)蛋白原液的纯化方法。该方法包括菌体破碎、镍离子螯合亲和层析、融合蛋白酶切、阴离子交换层析、反相层析以及阳离子交换层析的步骤，菌体破碎具体包括：取菌体，用缓冲液A重新悬浮，高压匀浆机破菌，破菌液离心，收集上清液，0.45μm滤芯过滤，收集滤过液，缓冲液A由磷酸盐缓冲液、NaCl、咪唑和水组成，其中，磷酸盐缓冲液的浓度为10mmol/L、NaCl的浓度为500mmol/L，咪唑的浓度为50～60mmol/L，缓冲液A的pH＝8.0。应用本发明的技术方案，rhPTH(1‑34)蛋白原液的总收率提高到50％以上，纯度提高到99.5％以上。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体而言，涉及一种rhPTH(1-34)蛋白原液的纯化方法。

背景技术

甲状旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)是甲状旁腺主细胞分泌的碱性单链多肽类激素。它的主要功能是调节脊椎动物体内钙和磷的代谢，促使血钙水平升高，血磷水平下降。PTH促使血浆钙离子浓度升高，其作用的主要靶器官是骨和肾脏。它动员骨钙入血，促进肾小管对钙离子的重吸收和磷酸盐的排泄，使血钙浓度增加和血磷浓度下降。此外，PTH还间接促进肠道对钙离子的吸收。PTH的分泌主要受血浆钙离子浓度的调节。血浆钙离子浓度升高，PTH的分泌即受到抑制；血浆钙离子浓度降低，则刺激PTH的分泌。

PTH的基因工程研究开始于20世纪80年代。目前制备PTH(1-34)的基因工程方法主要有两类，一类为以包涵体的形式制备，另一类以可溶蛋白的形式制备。其中，CN100484958C含有人甲状旁腺素1-34的融合蛋白及其表达载体公开了一种融合蛋白，其具有硫氧还蛋白序列和位于硫氧还蛋白下游的甲状旁腺激素1-34肽。较为优选的是，该融合蛋白还具有位于硫氧还蛋白序列和甲状旁腺激素1-34肽之间的含有蛋白水解酶识别位点的连接肽。从该融合蛋白可制备人甲状旁腺素1-34肽。但是，该技术方案中，rhPTH(1-34)蛋白原液的总收率仅为35％，因此，需要进一步的提高。

发明内容

本发明旨在提供一种rhPTH(1-34)蛋白原液的纯化方法，以提供rhPTH(1-34)蛋白原液的总收率。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种rhPTH(1-34)蛋白原液的纯化方法。该方法包括菌体破碎、镍离子螯合亲和层析、融合蛋白酶切、阴离子交换层析、反相层析以及阳离子交换层析的步骤，菌体破碎具体包括：取表达有rhPTH(1-34)蛋白的菌体，用缓冲液A重新悬浮，高压匀浆机破菌，破菌液离心，收集上清液，0.45μm滤芯过滤，收集滤过液，缓冲液A由磷酸盐缓冲液、NaCl、咪唑和水组成，其中，磷酸盐缓冲液的浓度为10mmol/L、NaCl的浓度为500mmol/L，咪唑的浓度为50～60mmol/L，缓冲液A的pH＝8.0。

进一步地，镍离子螯合亲和层析具体包括：用缓冲液A平衡的镍离子螯合亲和层析柱，以1.40～1.80g湿菌/ml填料的上样量上样至镍离子螯合亲和层析柱，采用缓冲液A淋洗，用缓冲液B洗脱，得到融合蛋白样品；超滤，置换液为缓冲液C。

进一步地，缓冲液B由磷酸盐缓冲液、咪唑和水组成，其中，磷酸盐缓冲液的浓度为10mmol/L、咪唑的浓度为110～210mmol/L，缓冲液B的pH＝8.0。

进一步地，缓冲液C为10mmol/L Tris-HCl，pH＝8.0。

进一步地，融合蛋白酶切具体包括：用50mmol/L Tris-HCl、1mmol/L CaCl₂，pH＝8.0的缓冲液将超滤后的融合蛋白稀释至1mg/ml，按1U肠激酶：6～8mg融合蛋白的酶解比例，在25℃的恒温摇床内酶切20小时。