[发明专利]一种SNK细胞的培养方法

说明书

本发明提供了一种SNK细胞的培养方法，属于医学、免疫学、细胞生物学和分子生物学技术领域，包括将携带有IL‑2基因的PBMC和携带有41BBL基因、MICA基因的PBMC进行共培养，得到SNK细胞。携带有41BBL基因和MICA基因能够刺激CD56+CD16+NK细胞的增殖，使获得的SNK细胞对多种实体瘤的杀伤效果好，携带有IL‑2基因的PBMC在满足PBMC生长的条件下，不断表达IL‑2，无需再向培养体系中添加IL‑2。

技术领域

本发明属于医学、免疫学、细胞生物学和分子生物学技术领域，尤其涉及一种SNK细胞的培养方法。

背景技术

外周血分离的外周血单个核细胞(以下简称PBMC)体外培养时需要适量的细胞因子IL-2的诱导，使其分化成NK细胞，因此PBMC的细胞培养基中IL-2的作用相当关键。现有的NK细胞培养基OKM-100和OKM-200由于成本较高，细胞培养周期较长，从经济方面不利于生产使用。通用的RPMI-1640培养基价格虽低，但由于其不含细胞因子IL-2，因此需要每天向培养体系中补加适量的IL-2，造成实验操作繁琐和不便，因此寻找简便又经济的新型细胞培养体系变得尤为重要。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种SNK细胞的培养方法，不需要每天向培养体系中添加IL-2，就能够获得SNK细胞。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种SNK细胞的培养方法，包括以下步骤：

1)将IL-2基因连接到载体中，经慢病毒包装后感染PBMC，得到携带有IL-2基因的PBMC；

2)将41BBL基因和MICA基因连接到载体中，经慢病毒包装后感染PBMC，得到携带有41BBL基因、MICA基因的PBMC；

3)将所述步骤1)得到的携带有IL-2基因的PBMC和步骤2)得到的携带有41BBL基因、MICA基因的PBMC进行共培养，得到SNK细胞。

优选的，所述步骤1)IL-2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

优选的，所述步骤2)41BBL基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

优选的，所述步骤2)MICA基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

优选的，所述41BBL基因和MICA基因通过第一连接基因进行连接，将得到的连接序列连接到载体中，所述第一连接基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

优选的，所述步骤3)携带有IL-2基因的PBMC和携带有41BBL基因、MICA基因的PBMC的体积比为(450～550):(0.5～1.5)。

优选的，所述步骤1)IL-2基因与GFP基因通过第二连接基因连接后，将得到的连接序列连接到载体中，所述第二连接基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

优选的，所述载体包括pCDH载体。

优选的，所述GFP基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

优选的，所述培养的温度为35～42℃，所述培养在5％CO₂下进行。

本发明提供了一种SNK细胞的培养方法，包括以下步骤：1)将IL-2基因连接到载体中，经慢病毒包装后感染PBMC，得到携带有IL-2基因的PBMC；2)将41BBL基因和MICA基因连接到载体中，经慢病毒包装后感染PBMC，得到携带有41BBL基因和MICA基因的PBMC；3)将所述步骤1)得到的携带有IL-2基因的PBMC和步骤2)得到的携带有41BBL基因、MICA基因的PBMC进行共培养，得到SNK细胞。