[发明专利]一种用于定性参苓白术散的引物、试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种用于检测中成药“参苓白术散”中多个主药的引物、检测试剂以及试剂盒和方法。本发明采用一种改进的CTAB方法从中成药“参苓白术散”提取基因组DNA，对基因组DNA进行全基因组扩增，改善DNA的质量，设计特异性引物，并采用突变扩增系统‑荧光定量PCR方法实现同时检测“参苓白术散”的多种主药成分。本发明可以精确地对人参、茯苓、白术、山药、莲子和薏苡仁等六种成分的特异基因，从而准确地判断出参苓白术散样品中是否含这六种组分，为中成药的监测提供强有力的支持。

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，具体地说，涉及一种基于ARMS-荧光定量PCR法同时检测“参苓白术散”多种主药成分的引物、试剂盒及方法。

背景技术

药用植物可以作为药品、保健品，相关产业发达，但是药用植物的掺假现象极其严重。中药掺假不仅降低了药效，还容易产生毒副作用。由多种药用植物加工的复合型产品，如中成药，成分隐蔽，更难以鉴别。当前，多种科学方法用于药用植物的鉴定，包括宏观形态学分析、显微观察、多种色谱分析，基因鉴定。中成药“参苓白术散”是一种常见的散剂，根据《宋·太平惠民和剂局方》和《中国药典》的记载，其加工方法为：莲子肉(去皮)、薏苡仁、缩砂仁、桔梗(炒令深黄色)，各一斤。白扁豆(姜汁浸.去皮.微炒)一斤半，白茯苓、人参(去芦)、甘草(炒)、白术、山药，各二斤，粉碎成细粉，过筛，混匀，得到成品。由于“参苓白术散”经过深加工，形态学分析，显微观察等宏观方法无法进行，多种色谱分析的设备昂贵，时间漫长，无法成为一种方便的检测方法。因此，基因鉴定是一种方便性，可靠性俱佳的中药成分鉴定方法。

既往研究发现，一组基因可以作为植物物种基因鉴定的一种标准，其编码的基因序列被称为DNA条形码。用做DNA条形码的基因的特点是：同一种植物，其编码序列完全相同，或者高度相似；而其他物种随着亲缘关系由近到远，其编码序列相似性逐步越低。对中成药的物种鉴定，本质上对多个物种基因组的混合物，进行基因分型。多个物种的ITS2基因差异，主要是各种点突变，包括单核苷酸突变，单核苷酸缺失，单核苷酸插入等。

中成药的基因分型主要有四大类：第一类是目前常规的Sanger测序法，也称DNA条形码方法。主要实验步骤为：首先，对植物进行基因组DNA的提取；其次，用一套ITS2基因的通用引物，对基因组DNA进行PCR扩增，并对扩增产物进行Sanger测序；最后，将测序结果与数据库中各个物种ITS2的基因序列进行比对分析，确定药用植物的物种。该方法是物种鉴定的标准，但是需要昂贵的仪器设备、周期长、工作繁琐。第二类是基于PCR的方法，如PCR-PFLP、PCR-芯片杂交法等。这一类方法的共同缺陷是在进行PCR以后，还需要进行酶切、电泳、杂交等操作，反应时间长，检测准确率低、通量低，这类方法都不适用于大量样本，也不适合常规操作。第三类是基于高通量测序方法。高通量测序法基本过程与Sanger测序方法相似，尤其是可以获得任意植物混合物中所有未知的物种的信息。但是高通量测序的缺点为成本太过高昂，时间周期过长，不适用于常规操作及推广。

第四类基于荧光定量PCR方法，更广泛适用于各种常规基因鉴定。其中，TaqMan探针法，针对特定的物种设计PCR引物和TaqMan探针。探针的5’-端和3’-端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，探针的序列与待鉴定物种完全匹配，而与其他容易混淆的物种不完全匹配。当荧光定量PCR反应体系中存在特定物种的基因组时，该探针与模板形成互补双链，产生了适合于核酸外切酶活性的底物。当PCR扩增时，DNA聚合酶将探针5’-端连接的荧光分子从探针上切割下来，发出荧光。这种方法精确，但主要缺点为探针合成的成本高，保存期短。