[发明专利]NTS/dNTS组合在制备植物突变体中的应用

权利要求书

1.一种植物基因替换的方法，包括如下步骤：将esgRNA、Cas9切刻酶、筛选剂抗性蛋白、供体DNA导入目的植物中；

所述esgRNA靶向DNA片段甲靶点序列；所述DNA片段甲靶点序列位于目的植物基因组中的转录链上；

所述esgRNA结构如下：tRNA-所述DNA片段甲靶点序列转录的RNA-esgRNA骨架；

所述tRNA为将序列1第474-550位中的T替换为U得到的RNA分子；

所述esgRNA骨架为将序列1第571-656位中的T替换为U得到的RNA分子；

所述Cas9切刻酶为Cas9 D10A切刻酶；

所述Cas9 D10A切刻酶为SpCas9n蛋白质；

所述SpCas9n蛋白质的氨基酸序列如序列3所示；

所述Cas9切刻酶带有核定位信号；

所述核定位信号为SV40 NLS；

所述SV40 NLS的氨基酸序列如序列2所示；

所述Cas9切刻酶与所述筛选剂抗性蛋白通过依次由启动子、所述Cas9切刻酶的编码基因、自切割寡肽的编码基因、所述筛选剂抗性蛋白的编码基因和终止子组成的表达盒导入目的植物中；

所述自切割寡肽为来源于猪捷申病毒-1的2A自切割寡肽；

所述来源于猪捷申病毒-1的2A自切割寡肽的氨基酸序列如序列4所示；

所述筛选剂抗性蛋白为潮霉素磷酸转移酶；

所述潮霉素磷酸转移酶的氨基酸序列如序列5所示；

所述供体DNA的转录链依次包括所述DNA片段甲靶点序列、DNA片段乙和所述DNA片段甲靶点序列；

在所述esgRNA引导下，所述Cas9切刻酶或其变体在目的植物基因组中的DNA片段甲靶点序列的非转录链上产生一个单链DNA切刻，在所述供体DNA中的DNA片段甲靶点序列的非转录链上产生两个单链DNA切刻，并通过目的植物体内的修复机制将目的植物基因组中的所述DNA片段甲替换为所述DNA片段乙，实现植物基因替换；

所述DNA片段甲为序列5第1300-1993位所示的DNA分子；

所述DNA片段乙为序列1第8513-9206位所示的DNA分子；

所述植物为水稻。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述SpCas9n蛋白质的编码基因如序列1第2887-6987位所示。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述潮霉素磷酸转移酶的编码基因如序列1第7195-8220位所示。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述将esgRNA、Cas9切刻酶或其变体、筛选剂抗性蛋白、供体DNA导入植物中的方法包括如下步骤：将转录esgRNA的DNA分子、Cas9切刻酶或其变体的编码基因、筛选剂抗性蛋白的编码基因和供体DNA导入目的植物中。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述转录esgRNA的DNA分子、所述Cas9切刻酶或其变体的编码基因、所述筛选剂抗性蛋白的编码基因和所述供体DNA通过重组表达载体导入目的植物中。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体包括依次由启动子、所述转录esgRNA的DNA分子和终止子组成的表达盒和依次由启动子、所述Cas9切刻酶或其变体的编码基因、自切割寡肽的编码基因、筛选剂抗性蛋白的编码基因和终止子组成的表达盒。

7.权利要求1-6任一所述的方法在植物基因编辑中的应用；所述植物为水稻。

8.权利要求1-6任一所述的方法在制备植物突变体中的应用；所述植物为水稻。

9.权利要求1-6任一所述的方法在提高植物基因替换效率中的应用；所述植物为水稻。

10.权利要求1-6任一所述的方法在减少植物基因替换产生的副产物中的应用；所述植物为水稻。