[发明专利]NTS/dNTS组合在制备植物突变体中的应用

说明书

本发明公开了NTS/dNTS组合在制备植物突变体中的应用。该方法包括如下步骤：将esgRNA、Cas9切刻酶、筛选剂抗性蛋白、供体DNA导入植物中；esgRNA靶向DNA片段甲靶点序列；DNA片段甲靶点序列位于植物基因组中的转录链上；供体DNA的转录链依次由DNA片段甲靶点序列、DNA片段乙和DNA片段甲靶点序列组成；DNA片段乙为将DNA片段甲突变后得到的DNA分子；在esgRNA引导下，Cas9切刻酶在植物基因组的非转录链上产生一个单链DNA切刻，在供体DNA的非转录链上产生两个单链DNA切刻，通过植物体内的修复机制将植物基因组中DNA片段甲替换为DNA片段乙，实现植物基因替换。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及NTS/dNTS组合在制备植物突变体中的应用。

背景技术

长链DNA模板介导的基因精确替换在细胞中的概率非常低，但是在待替换位点附近引入DNA双链断裂(dsDNA break，DSB)能够明显的增加替换的概率。CRISPR-Cas9技术已经成为强有力的基因组编辑手段，被广泛应用到很多组织和细胞中。CRISPR/Cas9protein-RNA复合物通过向导RNA(guide RNA)定位于靶点上，通过切割使DNA产生DSB，从而增加长链DNA模板介导的基因精确替换效率。在产生DSB后，生物体会本能的启动DNA修复机制。修复机制一般有两种，一种是非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)，此种修复所占的比例占大多数，修复DNA后一般会产生随机的indels(insertions or deletions)。另一种是同源重组(homology-directed repair，HDR)，使用姐妹染色单体或外源DNA供体(donor)作为修复模板，实现基因的精确修复。在动物细胞中，修复的具体原理是：CtIP酶在DSB处起始末端切割，产生突出的3’端单链DNA(single-stranded DNA，ssDNA)尾巴，ssDNA会被重组酶Rad51识别，结合成复合物，侵入供体DNA模板，并与其同源的片段退火结合，以供体DNA作为模板，合成新的DNA链，完成修复。当供体DNA同源臂之间的序列带有外源突变时，此突变会在修复的过程中引入到DNA链中，从而实现精确定点替换。此种HDR修复起始于DSB的产生，由于NHEJ的修复概率远大于HDR，在发生了精确替换的样品中，会有较多的副产物，比如引入indels，造成DNA大片段缺失、移位等。

为了提高产物中精确HDR:非精确HDR的比例，人们尝试使用Cas9的一种失活突变体D10A，对DNA造成单链切刻。在动物中，相比于DSB而言，单链切刻起始的HDR的副产物较少，但同时在一定程度上降低了HDR的效率。在植物中，DSB诱发的HDR在不同的基因上能够实现精确替换，但是Cas9D10A引发的切刻能否实现HDR精确替换，其效率是否比DSB诱导的HDR低，副产物是否减少，均无报道。

来源于病毒基因组的2A自切割寡肽(self-cleaving peptide 2A，P2A)，是一类长18-22个氨基酸的多肽，能够诱发重组蛋白的切割。自切割寡肽有多种类型，如：口蹄疫病毒(FMDV)(F2A)肽、马A型鼻炎病毒(ERAV)(E2A)肽、明脉扁刺蛾β四体病毒(Thosea asignavirus)(TaV)(T2A)肽、猪捷申病毒-1(PTV-1)(P2A)肽、泰勒病毒2A肽以及脑心肌炎病毒2A肽。第一个被发现的P2A序列来源于口蹄疫病毒。当被转录的一条mRNA链上含有P2A时，核糖体在此处发生跳跃事件，将P2A序列前后的两个蛋白分别翻译成两个独立的蛋白。在动物中，使用P2A将目的蛋白与荧光蛋白连接在一起共同表达，能够保证两个蛋白同时空表达，并且能够很好的对目的蛋白进行细胞定位。但是在植物中，使用P2A将目的蛋白与其它标记蛋白偶连在一起的报道非常少。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物基因替换的方法。

本发明提供的植物基因替换的方法包括如下步骤：将esgRNA、Cas9切刻酶(Cas9n)或其变体、筛选剂抗性蛋白、供体DNA导入目的植物中；