[发明专利]一种用于检测肿瘤组织C4BPB基因内含子保留异常剪切的方法及试剂盒

说明书

本发明涉及分子生物技术领域，公开了一种用于检测肿瘤组织C4BPB基因内含子保留异常剪切的方法及其从肿瘤组织检测C4BPB基因内含子保留异常剪切的试剂盒。该方法中C4BPB基因上游引物和下游引物分别位于待扩增靶向异常剪切点的两端，探针横跨异常剪切点；C4BPB基因探针5’端修饰有FAM或VIC，3’端修饰有NFQ‑MGB。利用本发明可以检测C4BPB基因4号和5号外显子是否发生内含子保留异常剪切事件，操作简单，灵敏度高，检测速度快，具有良好的临床应用前景。

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，具体涉及一种用于检测肿瘤组织C4BPB基因内含子保留异常剪切的方法及试剂盒。

背景技术

内含子保留（IR）是一种选择性剪接的形式，在哺乳动物系统中早已被人们忽略，尽管在非哺乳动物物种如植物，真菌，昆虫和病毒中已进行了数十年的研究。一般认为，错误剪接导致内含子的保留，除了通过无义介导的衰变而降低基因表达以外，没有任何生理后果。相对较新的标志性发现凸显了IR在正常和与疾病相关的人类生物学中的关键作用。通过内含子保留剪接的RNA剪接失调，这在肿瘤转录组中很常见，它代表了肿瘤新表位的另一个潜在来源，对肿瘤免疫治疗具有关键指导意义。

C4BPB基因编码一个蛋白质超家族的一个成员，主要由大约60个氨基酸组成的排列一致的短重复序列组成。由该基因编码的一条独特的β链由七条完全相同的α链组装成C4b结合蛋白的主要异构体，C4b结合蛋白是一种多聚蛋白，通过经典途径控制补体级联的激活。C4b结合蛋白在凝血系统中也具有调节作用，它通过维生素K依赖蛋白S的β链结合，作为活化蛋白C的辅助因子。C4BPB基因与C4和C2激活剂的产生和先天免疫系统有关。

目前临床上还没有专门的试剂盒针对基因内含子保留异常剪切进行检测。在之前的各种研究中，基因异常剪切一般都是通过基因测序来检测，而且需要很好的分析能力才能分析出准确的结果，价格高、检测周期长、分析难度大。因此，需要一种人类C4BPB基因内含子保留异常剪切的检测引物及检测试剂盒，用于C4BPB基因内含子保留异常剪切的检测。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种用于检测肿瘤组织C4BPB基因内含子保留异常剪切的方法，所述方法包括以下步骤：步骤1：提取检测样本中的RNA,所述样本需来自新鲜样本，例如新鲜血液、手术切除/穿刺的肿瘤新鲜样本/超低温冷冻样本/保存在RNA稳定液中的样本；步骤2：将提取的RNA逆转录为cDNA；步骤3：以cDNA为模板，在异常剪切点靶标区域分别设计相应引物对和探针，其中C4BPB基因上游引物和下游引物分别位于待扩增靶向异常剪切点的两端，探针横跨异常剪切点；步骤4：以步骤2中的cDNA为模板，用步骤3中设计的引物和探针进行实时荧光PCR扩增反应；步骤5：根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果：监测反应体系的FAM和VIC荧光强度，以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值大于等于38：阴性；，Ct值小于38：阳性。

在一种实施方式中，步骤3中设计C4BPB基因4号外显子3’端异常剪切的上游引物和下游引物分别位于4号外显子区和下游内含子区，探针设计位置横跨C4BPB基因4号外显子3’端异常剪切点。

在一种实施方式中，所述C4BPB基因4号外显子3’端异常剪切的上游引物为SEQ IDNO:1：CCTGTGCTGGTGAATGGAGA，所述C4BPB基因4号外显子3’端异常剪切的下游引物为SEQID NO:2：ACCTAGTAGGACAGGACCCC，所述C4BPB基因4号外显子3’端异常剪切的探针为SEQ IDNO:3：AGTAGTAAGTACAAGAGA。

在一种实施方式中，步骤3中设计C4BPB基因5号外显子5’端异常剪切的上游引物和下游引物分别位于5号外显子上游内含子区和5号外显子区，探针设计位置横跨C4BPB基因5号外显子5’端异常剪切点。