[发明专利]用于荧光素酶和核苷磷酸的发光检测的稳定制剂

说明书

本发明公开了含有用于产生光的D‑荧光素和L‑荧光素以及荧光素酶的混合物的方法、试剂盒和组合物，当随时间流逝储存时，所述组合物具有改善的稳定性。D‑荧光素和L‑荧光素的混合物可以用来检测样品中的ATP或者荧光素酶的存在或量。

相关申请的交叉引用

本申请是中国专利申请201480010140.5号的分案申请，要求2013年2月22日提交的美国临时申请No.61/767,875和2013年3月14日提交的美国临时申请No.61/783,726的优先权，这两个临时申请均通过引用的方式整体并入本文。

背景技术

荧光素是外消旋化合物，在溶液中，其由D-荧光素外消旋至L-荧光素或者由L-荧光素外消旋至D-荧光素。D-荧光素可以用作荧光素酶的底物而产生光，而L-荧光素很大程度上是抑制性的并且导致发光减少。由于D-荧光素底物的可用性的变化和降低以及L-荧光素的抑制作用，在储存过程中D-荧光素至L-荧光素的缓慢外消旋对于利用荧光素酶活性的测定存在问题。

技术领域

本公开涉及用于测定酶和代谢产物的组合物、方法和试剂盒。

发明内容

在某些实施方案中，提供了包含荧光素酶、L-荧光素和D-荧光素的组合物，其中所述组合物基本上不含ATP。在某些实施方案中，提供了包含ATP、L-荧光素和D-荧光素的组合物，其中所述组合物基本上不含荧光素酶。

在一些实施方案中，提供了包含D-荧光素、L-荧光素和ATP的组合物。

在某些实施方案中，提供了包含荧光素酶、L-荧光素和D-荧光素和ATP的组合物，其中所述L-荧光素的浓度超过所述D-荧光素的浓度。

在一些实施方案中，提供了包含组合物的试剂盒，所述组合物包含荧光素酶、L-荧光素和D-荧光素，所述组合物基本上不含ATP且包装在容器中。所述试剂盒可以包括至少一种额外组分，例如一种或多种洗涤剂，例如十二烷基三甲基铵、羟基聚乙氧基十二烷，磷酸钾、消泡剂、缓冲剂、盐和螯合剂，例如乙二胺四乙酸(EDTA)。

在一些实施方案中，提供了包含组合物的试剂盒，所述组合物包含D-荧光素、L-荧光素和ATP，其中所述L-荧光素的浓度超过所述D-荧光素的浓度。所述试剂盒可以包括至少一种额外组分，例如一种或多种洗涤剂，例如十二烷基三甲基铵、羟基聚乙氧基十二烷，磷酸钾、消泡剂、缓冲剂、盐和螯合剂，例如乙二胺四乙酸(EDTA)。

在一些实施方案中，提供了包含组合物的试剂盒，所述组合物包含L-荧光素、D-荧光素和ATP，所述组合物基本上不含荧光素酶且包装在容器中。所述试剂盒可以包括至少一种额外组分，例如缓冲剂、二价阳离子螯合剂、镁盐、离子型或非离子型洗涤剂、含硫醇化合物，如辅酶A或DTT、一种或多种含硫还原剂或其组合。

在一些实施方案中，提供了用于测定样品中ATP的存在或量的方法，其中使包含荧光素酶、L-荧光素和D-荧光素的组合物与样品接触并检测和/或测量产生的发光度以测定样品中ATP的存在或量。

在一些实施方案中，提供了用于测定样品中荧光素酶的存在或量的方法、试剂盒或组合物，其中使包含D-荧光素、L-荧光素和ATP的组合物与样品接触，所述样品可以含有表达荧光素酶的细胞。然后检测和/或测量产生的发光度以测定样品中荧光素酶的存在或量。含有表达荧光素酶的细胞的样品可以是裂解的细胞、未加工的细胞提取物或澄清的细胞提取物。

在一些实施方案中，提供了用于检测来自表达荧光素酶的细胞的荧光素酶活性的方法，其中荧光素酶在细胞中表达，并且使所述细胞与包含L-荧光素和D-荧光素的混合物接触，在所述混合物中所述L-荧光素与所述D-荧光素的比率为至少约5:95至约75:25。在一些实施方案中，所述混合物包含L-荧光素和D-荧光素，所述L-荧光素和所述D-荧光素的比率为至少约5:95至约55:45，或至少约5:95至约50:50。然后检测和/或测量产生的发光度以测定细胞中荧光素酶的存在或量。