[发明专利]一种血源人凝血因子VIII生产工艺

权利要求书

1.一种血源人凝血因子VIII生产工艺，其特征在于，在进行S/D病毒灭活后进行两次离子交换层析，合并两次洗脱峰溶液后配制产品；

包括以下步骤：

（1）血浆制备冷沉淀；冷沉淀溶解，杂质去除；（2）S/D病毒灭活；（3）离子交换层析，第一次离子交换层析后收集洗涤溶液进行第二次离子交换层析，合并两次洗脱峰溶液后配制；（4）分装，冻干，干热；

步骤（3）中第一次离子交换层析为弱阴离子交换层析，采用ToyopealDEAE-650M凝胶；第二次离子交换层析为强阴离子交换层析，采用Capto Q或Fractogel EMD TMAE。

2.根据权利要求1所述的一种血源人凝血因子VIII生产工艺，其特征在于，两次离子交换层析，其具体步骤如下：

第一次离子交换层析：

上样S/D灭活后的溶液；

使用缓冲液洗涤层析柱，直至波长280nm的紫外吸收值恢复或者接近基线水平，根据波长280nm的紫外吸收值收集洗涤溶液；

最后用的缓冲液洗脱层析柱，根据波长280nm的紫外吸收值收集洗脱峰溶液；

第二次离子交换层析：

第一次离子交换洗涤溶液收集结束后，立即用注射用水稀释至原体积的1.5倍~5倍，上样，再使用缓冲液洗涤层析柱，直至波长280nm的紫外吸收值恢复或者接近基线水平；

最后用缓冲液洗脱层析柱，根据波长280nm的紫外吸收值收集洗脱峰溶液。

3.根据权利要求2所述的一种血源人凝血因子VIII生产工艺，其特征在于，第一次离子交换层析，层析柱使用前用含有10~30mmol/L枸橼酸钠、50~200mmol/L氯化钠、50~200mmol/L甘氨酸、0.5~5mmol/L氯化钙，pH为6.5~7.5的缓冲液平衡3~5个柱体积；第二次离子交换层析，层析柱使用前用含有10~30mmol/L枸橼酸钠、50~300mmol/L氯化钠、50~200mmol/L甘氨酸、0.5~5mmol/L氯化钙，pH为6.5~7.5的缓冲液平衡3~5个柱体积。

4.根据权利要求2所述的一种血源人凝血因子VIII生产工艺，其特征在于，第一次离子交换层析，上样后使用缓冲液洗涤层析柱，使用的缓冲液含有10~30mmol/L枸橼酸钠、50~200mmol/L氯化钠、50~200mmol/L甘氨酸、0.5~5mmol/L氯化钙，pH为6.5~7.5；第二次离子交换层析，上样后使用缓冲液洗涤层析柱，使用的缓冲液含有10~30mmol/L枸橼酸钠、50~300mmol/L氯化钠、50~200mmol/L甘氨酸、0.5~5mmol/L氯化钙，pH为6.5~7.5。

5.根据权利要求2所述的一种血源人凝血因子VIII生产工艺，其特征在于，第一次离子交换层析，最后洗脱层析柱的缓冲液含有10~30mmol/L枸橼酸钠、50~300mmol/L氯化钠、50~200mmol/L甘氨酸、0.5~5mmol/L氯化钙，pH为6.5~7.5；

第二次离子交换层析，最后洗脱层析柱的缓冲液含有10~30mmol/L枸橼酸钠、0.4~1mol/L氯化钠、50~200mmol/L甘氨酸、0.5~5mmol/L氯化钙，pH为6.5~7.5。

6.根据权利要求2所述的一种血源人凝血因子VIII生产工艺，其特征在于，第一次和第二次离子交换层析，层析柱内上样量不超过100 IU人凝血因子VIII/ml凝胶；层析过程中控制流速20~200cm/h。

7.根据权利要求1所述的一种血源人凝血因子VIII生产工艺，其特征在于，合并两次洗脱峰溶液后配制产品，其具体步骤如下：

将两次收集的洗脱峰溶液合并，根据检测结果，用含50~200mmol/L氯化钠、50~200mmol/L甘氨酸，100~300g/L甘露醇，pH为7.0±0.5的缓冲液配制洗脱峰溶液至分装单位。

8.根据权利要求1所述的一种血源人凝血因子VIII生产工艺，其特征在于，（1）冷沉淀溶解，杂质去除，

冷沉淀用注射用水在15~35℃搅拌溶解，冷沉淀和注射用水的质量比例在1:2~1:5，用0.1mol/L的乙酸调节pH值为6.5~7.5，电导率小于4mS/cm；加入平衡好的DEAESephadexA50凝胶，A50凝胶的添加量为每千克冷沉淀1~2g干胶；搅拌吸附40~60分钟，离心除去凝胶和未溶解的沉淀；离心后的上清液再用0.1mol/L的乙酸调节pH值为6.2~6.5，并降低温度至12~18℃，通过离心分离沉淀；FVIII留在上清液当中；

（2）S/D病毒灭活，

离心后的上清液，经过澄清过滤后，加入1%体积比的聚山梨酸酯-80和0.3%体积比的磷酸三丁酯，24±1℃孵育6小时；

（4）分装，冻干，干热中所述的干热灭活温度为98~100℃，自制品温度升至98℃时计时，维持30分钟。