[发明专利]一种应用于酵母细胞中HCP残留的去除方法

说明书

本发明提供了一种应用于酵母细胞中HCP残留的去除方法，属于生物工程技术领域。本发明对酵母细胞液进行阳离子层析、疏水层析、CHT层析、阳离子层析后，用HCP检测试剂盒检测HCP残留。本发明通过对工艺路线和参数的优化，去除酵母中HCP残留，尤其是酵母胞外表达的蛋白，虽然没有细胞破碎这一步骤，但是可以针对目前很多由于HCP和目的蛋白化学性质相近，比如等电点和分子量等因素，导致不容易去除HCP的问题，本发明对于该问题的解决方法进行开发，以便将残留浓度降至100ppm(ng/mg)以内，达到相关标准。本发明解决了目前发酵液中普遍存在HCP残留较多，并难以去除的问题，所得效果显著。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种应用于酵母细胞中HCP残留的去除方法。

背景技术

HCP为宿主细胞残留蛋白，是生物制品的关键质量属性(CQA)，直接影响着生物制品的安全性，有效性和稳定性。因此，在整个生物制品的生产环节中，我们需要将HCP去除或者使其达到可控的尽量低的水平。

目前，夹心法ELISA检测试剂盒是检测HCP残留的金标准。然而，这种方法高度依赖于试剂盒中抗HCP抗体对于总宿主细胞蛋白的覆盖率。若ELISA检测中使用的抗体覆盖率不足，可能在最终产品中漏检某些残留的HCP，进而可能在用药患者中引起免疫反应和其他药物安全性的问题。

同时我们也看到，因为注射剂中残留HCP引发患者不良反应，而导致项目搁置的事件也时有发生。美国药典和欧洲药典在2016和2017年相继对HCP抗体覆盖率检测提出了新的要求。

HCP大部分的等电点在3-6之间，因此可以通过相关工艺和参数进行去除，但目前还没有专门针对生物制品中HCP残留的去除，现有的大部分报道主要是针对动物细胞中HCP残留的去除，比如说CHO细胞中HCP残留的去除，主要是通过亲和方法去除的，没有专门针对酵母细胞中残留的去除，比如说毕赤酵母中HCP残留的去除。HCP残留在发酵液中普遍存在，尤其是在胞内较多，但是随着下游工艺的进行大部分该残留会被慢慢去除，但是有些是去不掉的，因此需要特殊的工艺路线和参数进行去除。

本发明主要是通过工艺路线和参数去除毕赤酵母中HCP残留，尤其是胞外表达的蛋白，虽然没有细胞破碎这一步骤，但是可以针对目前很多由于HCP和目的蛋白化学性质相近比如等电点和分子量等因素，不容易去除的问题，本发明对于该问题的解决方法进行开发，能够去除该残留以便达到相关标准。

发明内容

本发明的目的是提供一种应用于酵母细胞中HCP残留的去除方法，能够很好的去除酵母细胞中HCP的残留，达到相关标准。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种应用于酵母细胞中HCP残留的去除方法，该方法包括如下：

(1)对酵母细胞液进行阳离子交换层析，洗脱，收集洗脱峰，得洗脱样液；

(2)对步骤(1)所得洗脱样液进行疏水层析，洗脱，收集洗脱峰，得洗脱样液；

(3)对步骤(2)所得洗脱样液进行CHT层析，洗脱，收集洗脱峰，得洗脱样液；

(4)对步骤(3)所得洗脱样液进行阳离子层析，洗脱，收集洗脱峰，即可。

对步骤(4)所得洗脱样液HCP的检测：采用毕赤酵母HCP检测试剂盒F640检测HCP残留，该残留浓度至100ppm(ng/mg)以内，即符合相关标准。

进一步的，该方法具体包括如下步骤：

(1)对酵母细胞液进行阳离子层析，先用平衡缓冲液平衡层析柱，上样阶段用平衡缓冲液继续冲洗2个柱体积，分别以2.8～3.6％，8.2～11.8％，23.8～27.3％，47.9～51.5％，100％梯度的洗脱缓冲液，以2.0mL/min流速洗脱，收集洗脱峰，检测于280nm波长，得洗脱样液；