[发明专利]一种农杆菌介导的菊花转染体系的构建方法及其应用

权利要求书

1.一种农杆菌介导的菊花转染体系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以菊花无菌苗茎段为外植体，在预培养基中诱导培养4～7d，得愈伤组织；所述预培养基以B5培养基为基本培养基，还包括：2～3mg/L6-BA、0.5～1.0mg/L IAA、30～40g/L蔗糖和9～12g/L琼脂，pH 5.8～6.2；

(2)将农杆菌接种到含有50mg/L利福平的YEB培养基中，于28℃，180rpm条件下振荡培养24h后，将得到的菌液接种到新鲜的YEB培养基中，于28℃下，180rpm条件下振荡培养至OD₆₀₀为0.6～0.8，得农杆菌菌液；所述农杆菌中含有目的基因和筛选基因质粒；

(3)将乙酰丁香酮与所述愈伤组织和农杆菌菌液混合侵染8～20min，得侵染愈伤组织；

(4)将所述侵染愈伤组织接种于共培养培养基中进行共培养，得共培养愈伤组织；所述共培养培养基以B5培养基为基本培养基，还包括：2～3mg/L 6-BA、0.5～1.0mg/L IAA、30～40g/L蔗糖、9～12g/L琼脂和100～200μmol/L乙酰丁香酮，pH 5.8～6.2；

(5)将所述共培养愈伤组织接种至筛选培养基中进行筛选分化培养，得不定芽；所述筛选培养基以B5培养基为基本培养基，还包括：2～3mg/L6-BA、0.5～1.0mg/L IAA、30～40g/L蔗糖、9～12g/L琼脂、200～400mg/L羧苄青霉素和20～40mg/L潮霉素，pH 5.8～6.2；

(6)将所述不定芽接种于扩繁培养基中进行扩繁培养，得转基因菊花；所述扩繁培养基以B5培养基为基本培养基，还包括：0.3～0.5mg/L 6-BA、0.1～0.3mg/L IAA、30～40g/L蔗糖、9～12g/L琼脂和10～20mg/L潮霉素，pH 5.8～6.2；

步骤(1)和(2)之间不存在时间上的先后关系。

2.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤(1)所述菊花无菌苗茎段的厚度为0.5～2mm。

3.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤(1)所述诱导培养的温度为23±2℃，光照强度为2000～3000Lux，光照时间为10～12h/d。

4.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤(3)所述混合侵染时，所述乙酰丁香酮的浓度为100～200μmol/L。

5.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤(4)所述共培养的温度为23±2℃，共培养的时间为3～4天。

6.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤(5)所述筛选分化培养的温度为23±2℃，筛选分化培养的时间为2～3个月。

7.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤(6)所述扩繁培养的温度为23±2℃，扩繁培养的时间为1～2个月。

8.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤(6)得转基因菊花后，还包括对所述转基因菊花进行PCR检测。

9.根据权利要求8所述构建方法，其特征在于，所述PCR检测以所述转基因菊花的基因组DNA为模板，特异性引物根据步骤(2)所述目的基因设计。

10.权利要求1～9任一项所述构建方法在菊花育种中的应用。