[发明专利]一种农杆菌介导的菊花转染体系的构建方法及其应用

说明书

本发明提供了一种农杆菌介导的菊花转染体系的构建方法及其应用，涉及遗传转化技术领域，通过研究农杆菌转化时所涉及到的各项影响条件，包括培养基种类、激素种类及浓度、菌液浓度、侵染时间、侵染条件、共培养时间、抗生素浓度等，提供了一套适合菊花的农杆菌介导转化体系，提高转化率，获得更多的阳性转基因植株。利用本发明的构建方法，利用愈伤组织获得再生植株，再生率为90～95％；经PCR检测，转基因阳性率为70～90％，可用于获得难以通过传统育种方式生产的菊花新品种。

技术领域

本发明属于遗传转化技术领域，具体涉及一种农杆菌介导的菊花转染体系的构建方法及其应用。

背景技术

菊花(Chrysanthemum morifolium)起源于我国，有着3000多年的悠久历史，因其丰富的形态，艳丽的色彩和悠久的文化而深受人们的喜爱。菊花不但有观赏性，还有较高的食用及药用价值，多数的菊花品种还具有抗菌消炎、清热明目的作用，在我国古代医书中就有很多关于菊花入药的记录。观赏、药用及食用价值给菊花带来越来越高的经济价值，为了满足消费者的需要，菊花的种质资源不断丰富，不同花色、花型、花期的菊花不断上市，菊花的销售市场越来越活跃。但蓝色花色的菊花依然是空白，培养蓝色的转基因菊花新品种是近年来菊花育种的目标。

农杆菌介导的植物基因转化系统目前广泛应用于植物基因工程研究，在菊花的遗传转化中最大的难题是转化效率低：如在“农杆菌介导CBL基因对菊花品种‘C008’的转化(西北林学院学报，2017，32(1):184-189)”一文中介绍以菊花品种‘C008’无菌苗叶片作为外植体进行转化，最终转化率为12.2％，转化率较低；又如“菊花CmDREBa-2基因的同源转化及功能验证”(沈阳农业大学，硕士学位论文，2018)一文中对菊花品种‘早玉盘’进行遗传转化，转化率为37.5％。如何利用农杆菌介导菊花的高效遗传转化体系，则成为亟待解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种农杆菌介导的菊花转染体系的构建方法，可简单高效的对菊花进行遗传转化，同时能够突破菊花自身遗传屏障，获得难以通过传统育种方式生产的新品种。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种农杆菌介导的菊花转染体系的构建方法，包括以下步骤：(1)以菊花无菌苗茎段为外植体，在预培养基中诱导培养4～7d，得愈伤组织；所述预培养基以B5培养基为基本培养基，还包括：2～3mg/L 6-BA、0.5～1.0mg/L IAA、30～40g/L蔗糖和9～12g/L琼脂，pH 5.8～6.2；

(2)将农杆菌接种到含有50mg/L利福平的YEB培养基中，于28℃，180rpm条件下振荡培养24h后，将得到的菌液接种到新鲜的YEB培养基中，于28℃下，180rpm条件下振荡培养至OD₆₀₀为0.6～0.8，得农杆菌菌液；所述农杆菌中含有目的基因和筛选基因质粒；

(3)将乙酰丁香酮与所述愈伤组织和农杆菌菌液混合侵染8～20min，得侵染愈伤组织；

(4)将所述侵染愈伤组织接种于共培养培养基中进行共培养，得共培养愈伤组织；所述共培养培养基以B5培养基为基本培养基，还包括：2～3mg/L 6-BA、0.5～1.0mg/L IAA、30～40g/L蔗糖、9～12g/L琼脂和100～200μmol/L乙酰丁香酮，pH 5.8～6.2；

(5)将所述共培养愈伤组织接种至筛选培养基中进行筛选分化培养，得不定芽；所述筛选培养基以B5培养基为基本培养基，还包括：2～3mg/L6-BA、0.5～1.0mg/L IAA、30～40g/L蔗糖、9～12g/L琼脂、200～400mg/L羧苄青霉素和20～40mg/L潮霉素，pH 5.8～6.2；