[发明专利]一种基于细胞水平的结合膜蛋白抗体的筛选方法

权利要求书

1.用于测定针对膜蛋白的抗体对细胞表面的目标膜蛋白的结合活性的方法，其包括以下步骤：

(1)提供表面固定有表达所述目标膜蛋白的细胞的固相载体；

(2)将包含待测抗体的待测样品与所述固相载体表面接触；所述待测样品是细胞培养上清；

(3)将带有可检测标记的二级抗体与所述固相载体表面接触，所述二级抗体能够特异性结合所述待测抗体；

(4)检测所述固相载体表面的可检测标记，其包括以下步骤：测定所述固相载体表面的带有可检测标记的细胞的数量，以及测定所述固相载体表面的细胞总数，从而获得带有可检测标记的细胞在所有细胞中所占的比例；其中，所述可检测标记是荧光标记；

(5)基于所述比例产生剂量-反应曲线并由此获得待测抗体的EC₅₀，并将该EC₅₀与参考值进行比较，从而确定待测抗体对目标膜蛋白的结合活性。

2.权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(4)包括以下步骤：获得所述固相载体表面的荧光图像从而获得所述荧光图像的细胞计数，并且获得所述固相载体表面的明场图像从而获得所述明场图像的细胞计数，从而获得荧光标记的细胞在所有细胞中所占的比例。

3.权利要求1所述的方法，其中，所述参考值是基于对阳性对照样品实施上述步骤(1)-(4)之后所获得的比例获得的EC₅₀。

4.权利要求3所述的方法，其中，所述阳性对照样品是已知能够特异性结合所述目标膜蛋白的抗体。

5.权利要求1所述的方法，其中，所述待测抗体的EC₅₀通过下述方法获得：利用包含不同量的待测抗体的系列待测样品重复步骤(1)-(4)，从而产生剂量-反应曲线并由此测定该抗体的EC₅₀。

6.权利要求1所述的方法，其中，所述固相载体是微量培养板。

7.权利要求1所述的方法，其中，所述固相载体是6孔板、12孔板、24孔板、48孔板、或96孔板。

8.权利要求1所述的方法，其中，使用细胞成像微孔板检测仪实施步骤(4)。

9.权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)包括以下步骤：(1a)提供表达所述目标膜蛋白的细胞；(1b)将所述细胞固定于固相载体表面。

10.权利要求9所述的方法，其中，所述步骤(1b)包括：将细胞接种至固相载体，并使所述细胞沉降至固相载体表面；使用细胞固定剂对沉降至固相载体表面的细胞进行固定。

11.权利要求10所述的方法，其中，所述细胞的接种密度为1.5×10⁴/cm²至5×10⁴/cm²。

12.权利要求10所述的方法，其中，通过离心将所述细胞沉降至固相载体表面。

13.权利要求10所述的方法，其中，所述固定剂选自95％酒精、4％多聚甲醛、冰醋酸、甲醇、乙醚酒精、或其任意组合。

14.权利要求10所述的方法，其中，在步骤(1b)之后，还包括弃去所述固相载体中的液体的步骤。

15.权利要求9所述的方法，其中，所述步骤(1b)包括：将所述细胞接种至固相载体，在细胞培养基中，在促进细胞黏附于固相载体表面的条件下进行孵育。

16.权利要求15所述的方法，其中，所述细胞的接种密度为1.5×10⁴/cm²至5×10⁴cm²。