[发明专利]一种基于细胞水平的结合膜蛋白抗体的筛选方法

说明书

本发明涉及免疫学检测领域。具体而言，本发明提供了测定抗体对细胞表面的目标膜蛋白的结合活性的方法。该方法能够实现在细胞水平对融合瘤上清样品的高通量直接检测，且不受“钩状效应”干扰，具有广阔的临床和研究应用。

技术领域

本发明涉及免疫学检测。具体而言，本发明提供了测定抗体对细胞表面的目标膜蛋白的结合活性的方法。

背景技术

抗体药物是目前疾病治疗的重要产品，2018年全球药品销售额Top10中，抗体药物有8个，包括单抗药物6个，融合蛋白2个。抗体药物的研发方法目前有融合瘤、噬菌体展示和单B细胞测序三种，其中融合瘤是主流，目前已上市的单抗药物95％以上是通过融合瘤方法研究发现的。而通过融合瘤方法产生的上清抗体库小至数千，大至数万，需要合适的抗体筛选方法找出特异性结合目标抗原的抗体。经典的抗体筛选方法是通过酶联免疫吸附(ELISA)找到蛋白水平结合抗原的抗体，然后再通过流式细胞检测(FCM)进一步验证候选抗体在细胞水平的结合。ELISA中所使用的是抗原的蛋白形式，对于膜蛋白来说，重组表达的蛋白结构和其在细胞膜上的天然结构不可避免的存在差异，这就造成ELISA筛选对于后续FCM筛选的假阳性(ELISA水平结合但FCM水平不结合)/假阴性(FCM水平结合但因ELISA水平不结合没有被筛选出来)。为了避免ELISA筛选的假阳性/假阴性，以Mirrorball为代表的基于荧光微量分析的细胞水平结合筛选应运而生。然而无论是传统的ELISA，还是基于荧光微量分析均受到钩状效应(Hook效应)影响，给融合瘤上清的筛选带来极大问题。

钩状效应即Hook效应，是指由于抗原抗体比例不合适而导致假阴性的现象。抗原抗体特异性反应时，生成结合物的量与反应物的浓度有关。无论在一定量的抗体中加入不同量的抗原或在一定量的抗原中加入不同量的抗体，均可发现只有在两者分子比例合适时才出现最强的抗原-抗体反应。以沉淀反应为例，若向一排试管中加入一定量的抗体，然后依次向各管中加入递增量的相应可溶性抗原，根据所形成的沉淀物及抗原抗体的比例关系可绘制出反应曲线(图1)。曲线的高峰部分是抗原抗体分子比例合适的范围，称为抗原抗体反应的等价带。在此范围内，抗原抗体充分结合，形成的沉淀物最多。在等价带前后分别为抗体、抗原过剩则影响沉淀物的形成，这种现象称为带现象。带现象在临床检验中经常出现，特别是ELISA反应中。出现在抗体过量时，称为前带，出现在抗原过剩时，称为后带。临床检测中尤其以前带效应明显，通常所采取的解决方式是进一步稀释样本。

以Mirrorball为代表的基于荧光微量分析的细胞水平结合检测中也出现了Hook效应。细胞和抗体均相混合的情况下，抗体和细胞结合的量与两者的浓度相关。以Mirrorball和类似的ABI 8200FMAT检测平台为例，其检测抗EGFT抗体和A431细胞结合的抗体浓度依赖的荧光强度曲线如图2所示，在一定量的细胞体系中加入不同量的抗体，当抗体浓度超过0.1μg/mL，信号值会发生一个较强的荧光减少。使用荧光微量分析对融合瘤上清的抗体进行筛选的时候，表达量高亲和力强的阳性克隆会因为“钩状效应”发生信号降低而被错过。解决方法也是进一步稀释上清，但这样做会大大增加工作量。

因此，本领域需要开发用于筛选抗体特别是结合膜蛋白抗体的改进方法。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了筛选针对膜蛋白抗体的改进方法，该方法能够实现在细胞水平对融合瘤上清样品的高通量直接检测，且不受“钩状效应”干扰，具有广阔的临床和研究应用。

筛选方法

在一个方面，本发明提供了用于测定针对膜蛋白的抗体对细胞表面的目标膜蛋白的结合活性的方法，其包括以下步骤：

(1)提供表面固定有表达所述目标膜蛋白的细胞的固相载体；

(2)将包含待测抗体的待测样品与所述固相载体表面接触；

(3)将带有可检测标记的二级抗体与所述固相载体表面接触，所述二级抗体能够特异性结合所述待测抗体；