[发明专利]一种基于PD-1高表达T细胞的T细胞受体的单细胞测序方法

说明书

本发明公开了一种基于PD‑1高表达T细胞的T细胞受体的单细胞测序方法，通过本方法，可以对具有PD‑1高表达，抗肿瘤活性比较高的T细胞进行单细胞T细胞测序，从而获得该群T细胞的受体情况，通过对T细胞受体的分析和研究，可以拿到针对特定患者，特定肿瘤抗原特异性的T细胞受体，从而为后续制备嵌合抗原受体T细胞(CAR‑T)和T细胞受体改造T细胞(TCR‑T)提供遗传学基础。

技术领域

本发明属于生物免疫检测技术领域，具体涉及一种基于PD-1高表达T细胞 的T细胞受体的单细胞测序方法。

背景技术

PD-1受体是表达在T细胞表面的一种免疫抑制性受体，它的高表达和激活 通常会造成T细胞的大量失活与死亡。通常情况下，在长期的慢性感染以及某类 肿瘤性疾病，由于T细胞持续活化参与机体的防御，从而为了调控其活性不至于 发生免疫过度激活导致的自身免疫疾病。在高度活化的T细胞表面常常有PD-1 受体的过度表达，与此同时，某些肿瘤组织则高度表达PD-1受体的配体PD-L1， PD-L1和PD-1的结合将会开启T细胞失活和凋亡的信号通路，从而消灭抗肿瘤T 细胞，导致该类肿瘤患者肿瘤免疫极度低下。由上文可知，PD-1高表达的T细 胞通常是过度激活/过度反应的T细胞，因此，其在很大程度上是具备抗肿瘤活 性的T细胞。对此类T细胞的T细胞受体进行研究理论上可以获得大量针对肿瘤 抗原有特异反应的T细胞受体，从而为后续的肿瘤免疫治疗提供患者/肿瘤特异 性靶定机制。制备嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)和T细胞受体改造T细胞(TCR-T) 最关键的步骤就是获取患者/肿瘤特异性抗原靶定机制。目前，尚无对此类对 PD-1高表达T细胞的T细胞受体进行检验测序方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于PD-1高表达T细胞的T细胞受体的单细胞测 序方法，通过本方法，可以对具有PD-1高表达，抗肿瘤活性比较高的T细胞进 行单细胞T细胞测序，从而获得该群T细胞的受体情况，通过对T细胞受体的分 析和研究，可以拿到针对特定患者，特定肿瘤抗原特异性的T细胞受体，从而为 后续制备嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)和T细胞受体改造T细胞(TCR-T)提供 遗传学基础。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种基于PD-1高表达T细胞的T细胞受体的单细胞测序方法，包括以下 步骤：

1)从待测T细胞中分选和富集PD-1高表达T细胞；

2)通过微流控液滴技术制备单细胞转录组文库；

3)采用二代测序技术对转录组文库进行TCR定向测序。

优选地，上述方法还包括：通过物理性或酶消化分离方法从待测外周静脉 血和/或肿瘤组织中得到待测T细胞。

更优选地，所述待测外周静脉血和/或肿瘤组织均来自肿瘤患者。

优选地，步骤1)包括：通过荧光标记PD-1抗体对待测T细胞进行标记， 再通过流式细胞分选进一步分离和富集。

更优选地，富集出PD-1高表达的T淋巴细胞亚群CD4⁺PD-1^高和CD8⁺PD-1 ^高细胞。

优选地，上述方法还包括：分析测序拿到的T细胞受体的组织以及其抗原 互补区域(CDR)的序列。

更优选地，通过对CDR的生物信息学分析，以及对外周静脉血T细胞的T 细胞受体和肿瘤侵润T细胞的T细胞受体进行对比，获得针对肿瘤特异性T细胞 受体。

本发明的有益效果如下：