[发明专利]一种虎源伪狂犬病毒的检测试剂盒及检测方法在审
| 申请号： | 201911414529.7 | 申请日： | 2019-12-31 |
| 公开（公告）号： | CN111560466A | 公开（公告）日： | 2020-08-21 |
| 发明（设计）人： | 范克伟;林开雄;包银莉;郑琳;傅文源;黄翠琴;杨守深 | 申请（专利权）人： | 龙岩学院;福建梅花山华南虎繁育研究所;青岛英赛特生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/70 | 分类号： | C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11 |
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| 地址： | 364012 福*** | 国省代码： | 福建;35 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 虎源伪 狂犬病毒 检测 试剂盒 方法 | ||
1.一种虎源伪狂犬病毒的检测试剂盒，其特征在于基于CycleavePCR技术，包括以下引物对和探针：
检测虎源伪狂犬病毒的引物对和Cycling探针，所述检测虎源伪狂犬病毒的引物对为SEQIDNO：1所示的上游引物Tiger-RPV-F和SEQIDNO：2所示的下游引物Tiger-RPV-R，所述Cycling探针为探针Tiger-RPV-Pro且其序列为SEQIDNO：3所示。
2.根据权利要求1所述的一种虎源伪狂犬病毒的检测试剂盒，其特征在于：所述上游引物Tiger-RPV-F、下游引物Tiger-RPV-R、探针Tiger-RPV-Pro的终浓度均为2mM到10mM。
3.根据权利要求1或2所述的一种虎源伪狂犬病毒的检测试剂盒，其特征在于：所述探针Tiger-RPV-Pro的5'标记的荧光基团为FAM、VIC、HEX、CY5中的一种；所述探针Tiger-RPV-Pro的3'标记的淬灭基团为BQ1、BQ2中的一种。
4.根据权利要求1所述的一种虎源伪狂犬病毒的检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒中还包括有酶液和反应缓冲液，所述酶液由DNA聚合酶和RNA酶H组成。
5.根据权利要求1所述的一种虎源伪狂犬病毒的检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒中还包括有阴性对照和阳性对照；所述阴性对照为用0.01mol/L、pH7.2的PBS缓冲盐水；所述阳性对照为将虎源伪狂犬病毒PCR扩增产物与克隆载体pMD-18-T vector连接，转化大肠杆菌感受态DH5α，获得阳性克隆菌株，并制备质粒pMD18-tiger-RPV作为阳性对照。
6.一种权利要求要求1所述的虎源伪狂犬病毒的检测试剂盒的检测方法，其特征在于按照以下步骤进行：
(1)提取待测病毒核酸模板，选用商品化的病毒核酸提取试剂盒；
(2)配置扩增反应体系，体系为：17μLCycleavePCR扩增反应液，3μL待测病毒核酸模板，反应体系的总体积为20μL；
(3)荧光定量PCR扩增：将步骤(2)配制好的扩增反应体系置于荧光定量PCR仪中进行扩增，并进行信号采集；
(4)结果判定：在相应通道查看扩增曲线在36个循环以内曲线良好的反应直接判定为阳性，36个循环以后的可直接判定为阴性，同时阳性对照的扩增明显，阴性对照没有扩增。
7.根据权利要求6所述的一种虎源伪狂犬病毒的检测试剂盒的检测方法，其特征在于：所述CycleavePCR扩增反应液包含10μL的2X CycleavePCR Reaction Mixture，各0.5μL权利要求1中所述的引物和探针，剩余为无菌水。
8.根据权利要求6所述的一种虎源伪狂犬病毒的检测试剂盒的检测方法，其特征在于所述扩增反应条件：预变性95℃预变性30s；95℃变性10s，50℃退火30s，72℃延伸30s并采集荧光信号40个循环。
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