[发明专利]一种虎源伪狂犬病毒的检测试剂盒及检测方法

说明书

本发明属于动物疫病分子生物学检验方法及检验试剂领域，特别涉及一种虎源伪狂犬病毒的检测试剂盒及检测方法，通过对5株虎源伪狂犬病毒进行高通量测序后组装获得虎源伪狂犬的全基因组序列，并与多株猪伪狂犬病毒进行比对发现虎源伪狂犬病毒基因组中存在多处单核酸突变，发明针对其中一个单核苷酸突变进行检测虎源伪狂犬病毒，设计一对伪狂犬病毒的检测引物和一条检测虎源伪狂犬病毒的Cycling探针组成检查试剂盒，虎源伪狂犬病毒的检测，该检测方法具有操作简便、敏感性高、特异性强和重复性好等优点，反应结束即时便可根据扩增曲线判定结果。

技术领域

本发明属于动物疫病分子生物学检验方法及检验试剂领域，特别涉及一种虎源伪狂犬病毒的检测试剂盒及检测方法。

背景技术

虎源伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)感染引起的家畜及野生动物的急性传染病，是引起世界养猪业重大经济损失的病原之一。猪是该病的储存宿主和主要传染源，临床症状以发热、神经系统和呼吸障碍为主要特征。哺乳期仔猪和幼猪对该病毒最为敏感，感染后，体重和食欲下降，死亡率为50-100％。PRV也称作猪疱疹病毒1型，属疱疹病毒科。狂犬病病毒同时也会感染老虎，危及濒危动物生命安全。

目前伪狂犬病毒的常规检测方法包括：1)病原学诊断，即病毒分离﹑病毒接种及动物感染，被称为诊断伪狂犬病毒的黄金标准；2)血清学方法：琼脂免疫扩散试验(AGID)、中和试验(NT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)；3)聚合酶链式反应(PCR)、巢式PCR、Taqman探针法等。但是病毒分离鉴定由于费时费力而不适于临床检测；由于病毒感染特异性抗体出现较晚，血清学方法也难以用于早期诊断，而且容易出现交叉反应，而且血清学方法也无法检测出虎源伪狂犬病毒。常规的PCR、巢式PCR等扩增反应后需要电泳检测，耗时较长；Taqman探针法特异性高，灵敏度也很好，但是普通Taqman无法检测单个核苷酸突变，无法区分虎源伪狂犬病毒和猪伪狂犬病毒。

CycleavePCR技术是由RNA和DNA构成的杂合Cycling探针与RNaseH组合使用的高灵敏度检测方法，能够高效率地检出目的基因。Cycling探针内部夹有RNA部分，5′端标记荧光物质，3′端标记淬灭物质，当探针处于完整状态时，由于荧光淬灭作用抑制荧光物质发出荧光，但当探针与扩增产物中的互补序列杂交后，RNaseH在RNA部分将探针切断，淬灭抑制作用解除，荧光物质发出荧光，通过测定荧光强度，能够实时监测扩增产物量。如果探针的RNA部分或与RNA部分相邻的2～3个碱基与模板不互补，RNaseH就不能在RNA部分将探针切断，所以该检出方法是一种即使一碱基不同也能识别的高特异性检出方法，特别适合于SNP解析。目前已经拥有多种猪伪狂犬病毒的检查方法，但是文献中没有检索到虎源伪狂犬病毒的检测技术。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种虎源伪狂犬病毒的检测试剂盒及检测方法，基于CycleavePCR技术，利用Cycling探针和RNaseH可以检查单个碱基的突变，进而可以用来检测虎源伪狂犬病毒；本发明一个PCR反应可以检测虎源伪狂犬病毒，填补了虎源伪狂犬病毒的检测技术空白，可用于虎源伪狂犬病毒鉴定，有利于开展流行病学调查，预防和控制疫情传播。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

本发明所述的一种虎源伪狂犬病毒的检测试剂盒，其特征在于基于CycleavePCR技术，包括以下引物对和探针：

检测虎源伪狂犬病毒的引物对和Cycling探针，所述检测虎源伪狂犬病毒的引物对为SEQIDNO：1所示的上游引物Tiger-RPV-F和SEQIDNO：2所示的下游引物Tiger-RPV-R，所述Cycling探针为探针Tiger-RPV-Pro且其序列为SEQIDNO：3所示。