[发明专利]大肠杆菌发酵培养基及发酵培养方法

权利要求书

1.大肠杆菌发酵培养基，其特征在于，包括如下组分：酵母提取物10-12g/L、磷酸氢二钠3-4g/L、磷酸二氢钾11.5-13.5g/L、硫酸铵1.5-2.5g/L、氯化铵0.5-1.0g/L、柠檬酸钠1.0-2.0g/L、葡萄糖10-12g/L和七水硫酸镁1.0-1.5g/L。

2.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，包括如下组分：酵母提取物10g/L、磷酸氢二钠4g/L、磷酸二氢钾13.5g/L、硫酸铵2.5g/L、氯化铵0.5g/L、柠檬酸钠2.0g/L、葡萄糖10g/L和七水硫酸镁1.0g/L。

3.权利要求1或2所述培养基在大肠杆菌发酵生产中的应用。

4.大肠杆菌发酵培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)一级种子制备；

2)二级种子制备；

3)将二级种子接入权利要求1所述培养基中，进行发酵培养。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌为表达重组结核杆菌变态反应原的重组大肠杆菌pET28a-EECC/BL21(DE3)。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1)包括：取200ul甘油管中保存的菌液加入装有200ml基础培养基的三角瓶中，37℃、200rpm振荡培养8-10小时，得到一级种子；

其中，所述基础培养基的配方为：酵母提取物10-12g/L、磷酸氢二钠3-4g/L、磷酸二氢钾11.5-13.5g/L、硫酸铵1.5-2.5g/L、氯化铵0.5-1.0g/L、柠檬酸钠1.0-2.0g/L和卡那霉素50mg/L。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)包括：按1‰v/v的比例将一级种子接种至装有200mL基础培养基的三角瓶中，37℃、200rpm振荡培养14-16小时，得到二级种子。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤3)包括：按10％v/v的比例将二级种子转接至装有发酵培养基的发酵罐中，装液量2.5L/5L，在29.5℃-37℃、通气量2-4NL/min，溶氧30％，转速200-600rpm的条件下进行发酵培养，发酵过程中，将发酵体系的pH值控制在7.0；待菌液OD₆₀₀值为8-12，加入IPTG至终浓度为0.2mM，诱导4-6小时后，结束发酵，离心收获菌体。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤3)还包括补料操作，具体如下：

按10％v/v的比例将二级种子转接至装有发酵培养基的发酵罐中，装液量2.5L/5L，在29.5℃-37℃、通气量2-4NL/min，溶氧30％，转速200-600rpm的条件下进行发酵培养，发酵过程中，将发酵体系的pH值控制在7.0；待菌液OD₆₀₀值大于1.0按如下方式进行补料：

第一次补料采用定时补料方式，向发酵罐中加入补料培养基①，补料量2％-3.6％/L，每小时补加60-85mL，当菌液OD₆₀₀值大于6.0停止补加补料培养基①，开始第二次补料；第二次补料采用定量补料的方式，向发酵罐中加入补料培养基②，补料量每小时50mL，当菌液OD₆₀₀值为8-12，进入诱导期；加入IPTG至终浓度为0.2mM，诱导4-6小时后，结束发酵，离心收获菌体；进入诱导期后开始第三次补料，同时加入补料培养基①和补料培养基②，补料培养基①每小时补料3.6％/L，补料培养基②每小时补料50mL，直至发酵结束；

所述补料培养基①为：葡萄糖400-500g/L、硫酸镁10-12g/L和微量元素溶液2mL/L；所述微量元素溶液的配方为：三氯化铁27g/L、六水合氯化钴2g/L、钼酸钠2g/L、氯化钙24.6g/L、无水硫酸铜1g/L、硼酸0.5g/L、三氯化铝10g/L和盐酸100mL/L，其中，盐酸的浓度为36％-38％；

所述补料培养基②为：240g/L酵母提取物溶液。