[发明专利]大肠杆菌发酵培养基及发酵培养方法

说明书

本发明提供一种大肠杆菌发酵培养基及发酵培养方法。所述发酵培养基包括组分：酵母提取物10‑12g/L、磷酸氢二钠3‑4g/L、磷酸二氢钾11.5‑13.5g/L、硫酸铵1.5‑2.5g/L、氯化铵0.5‑1.0g/L、柠檬酸钠1.0‑2.0g/L、葡萄糖10‑12g/L和七水硫酸镁1.0‑1.5g/L。本发明仅采用酵母提取物作为大肠杆菌发酵培养过程中的主要氮源，通过对发酵培养过程中的各种参数优化控制，获得目的蛋白的高效表达，可收获大量的生物产物。利用本发明提供的大肠杆菌发酵培养基，培养得到的生物湿菌产量不低于常规培养基，经过发酵过程的优化，生物湿菌产量可由20g/L提高至30g/L。

技术领域

本发明涉及大肠杆菌发酵领域，具体地说，涉及一种大肠杆菌发酵培养基及发酵培养方法。

背景技术

目前，常规的大肠杆菌发酵培养用培养基营养成分中均含有蛋白胨及酵母提取物。由于动物源蛋白胨引入的外源因子对人用产品可能带来风险。因此，在利用大肠杆菌制备的药物申报中限制使用动物源的蛋白胨，而采用植物源的蛋白胨进行发酵培养后，降低了目的蛋白产量并且增加了生产成本。

发明内容

本发明的目的是提供一种不添加动物源和植物源成分的大肠杆菌发酵培养基。

本发明的另一目的是提供上述培养基发酵培养大肠杆菌的方法。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种大肠杆菌发酵培养基，包括如下组分：酵母提取物10-12g/L、磷酸氢二钠3-4g/L、磷酸二氢钾11.5-13.5g/L、硫酸铵1.5-2.5g/L、氯化铵0.5-1.0g/L、柠檬酸钠1.0-2.0g/L、葡萄糖10-12g/L和七水硫酸镁1.0-1.5g/L。

优选地，所述大肠杆菌发酵培养基包括如下组分：酵母提取物10g/L、磷酸氢二钠4g/L、磷酸二氢钾13.5g/L、硫酸铵2.5g/L、氯化铵0.5g/L、柠檬酸钠2.0g/L、葡萄糖10g/L和七水硫酸镁1.0g/L。

第二方面，本发明提供所述培养基在大肠杆菌发酵生产中的应用。

第三方面，本发明提供一种大肠杆菌发酵培养方法，包括以下步骤：

1)一级种子制备；

2)二级种子制备；

3)将二级种子接入所述发酵培养基中，进行发酵培养。

本发明中，所述大肠杆菌可以是利用基因工程手段改造得到的工程菌，例如，表达重组结核杆菌变态反应原(结核分枝杆菌重组融合蛋白EECC)的重组大肠杆菌pET28a-EECC/BL21(DE3)，其构建方法可参见CN110423279A。

前述的方法，步骤1)包括：取200ul甘油管中保存的菌液加入装有200ml基础培养基的三角瓶中，37℃、200rpm振荡培养8-10小时，得到一级种子。

其中，所述基础培养基的配方为：酵母提取物10-12g/L、磷酸氢二钠3-4g/L、磷酸二氢钾11.5-13.5g/L、硫酸铵1.5-2.5g/L、氯化铵0.5-1.0g/L、柠檬酸钠1.0-2.0g/L和卡那霉素50mg/L。

步骤2)包括：按1‰v/v的比例将一级种子接种至装有200ml基础培养基的三角瓶中，37℃、200rpm振荡培养14-16小时，得到二级种子。

步骤3)包括：按10％v/v的比例将二级种子转接至装有发酵培养基的发酵罐中，装液量2.5L/5L，在29.5℃-37℃、通气量2-4NL/min，溶氧30％，转速200-600rpm的条件下进行发酵培养，发酵过程中，将发酵体系的pH值控制在7.0；待菌液OD₆₀₀值为8-12，加入IPTG至终浓度为0.2mM，诱导4-6小时后，结束发酵，离心收获菌体。