[发明专利]一种具有ACE抑制活性的河鲀多肽及其制备方法

权利要求书

1.一种具有ACE抑制活性的河鲀多肽，其特征在于，

所述多肽为八肽，氨基酸序列为LQLHFNVL(Leu-Gln-Leu-His-Phe-Asn-Val-Leu)。

2.根据权利要求1所述的具有ACE抑制活性的河鲀多肽，其特征在于，

所述八肽LQLHFNVL(Leu-Gln-Leu-His-Phe-Asn-Val-Leu)的分子量为982.6Da。

3.根据权利要求1所述的具有ACE抑制活性的河鲀多肽，其特征在于，

所述八肽LQLHFNVL(Leu-Gln-Leu-His-Phe-Asn-Val-Leu)的ACE抑制率的IC₅₀值为2.0-2.4umol/mL。

4.一种具有ACE抑制活性的河鲀多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：河鲀酶解液的制备

取河鲀鱼皮打浆后，加水搅拌形成蛋白溶液，调节PH值至碱性后加入碱性蛋白酶进行酶解，加酶量为450-600U/g，在50-60℃条件下酶解6-10h，保持pH值不变，酶解结束后进行灭酶处理，然后冷却至室温，调节PH值至中性后离心取上清液，上清液冷冻干燥，得到粗河鲀ACE抑制肽，将冷冻干燥后的粗河鲀ACE抑制肽加入水中配制成河鲀酶解液；

S2：河鲀酶解液的超滤分离

对河鲀酶解液进行澄清分离，然后对澄清的河鲀酶解液进行超滤处理，分别收集不同大小分子量的分离组分并冻干，测定各分离组分的ACE抑制率；

S3：多肽的分离纯化

将分子量小于1kDa的分离组分用半制备液相色谱进行初步分离纯化，半制备液相色谱采用2.5cm×20cm的SinoChrom ODS-BP色谱柱，上样量3-5mL，缓冲溶液采用10％甲醇溶液进行等度洗脱，洗脱流速5mL/min，收集得到8种不同吸收峰组分，按吸收峰的时间范围收集洗脱液，分别命名为A1-A8组分，然后进行ACE活性测定，选择A4组分并对其进行凝胶过滤分离，然后对凝胶过滤分离后的A4组分进行高效液相色谱进行进一步分离纯化，高效液相色谱采用4.6×250mm的sunfireC₁₈色谱柱，紫外检测波长为220nm，流动相A为含有质量分数0.4-0.6％TFA的纯水，流动相B为乙腈，平衡时，流动相A与流动相B的流动相体积比为75：25，流动相流速为0.8-1.2mL/min，温度为25℃，分离得到高纯度多肽组分；

S4：多肽的序列鉴定

对步骤S3分离得到的高纯度多肽组分进行质谱测定，对质谱测定的结果进行分析，得到八肽LQLHFNVL(Leu-Gln-Leu-His-Phe-Asn-Val-Leu)；

S5：多肽合成及活性测定

将所述八肽LQLHFNVL(Leu-Gln-Leu-His-Phe-Asn-Val-Leu)按测定的多肽序列进行固相合成，验证合成多肽的ACE抑制活性。

5.根据权利要求4所述的具有ACE抑制活性的河鲀多肽的制备方法，其特征在于，

所述步骤S1的具体步骤为：

取80-120g河鲀鱼皮打浆后，加入250-350mL蒸馏水中搅拌形成蛋白溶液，用NaOH调节PH值至7.5-9.0加入碱性蛋白酶，加酶量为450-600U/g，在50-60℃条件下酶解6-10h，保持pH值不变，酶解结束后在80-100℃条件下加热12-18min进行灭酶处理，然后冷却至室温，用HCl调节PH值至中性后以4000-6000r/min的速度离心8-12min后取上清液，上清液冷冻干燥，得到粗河鲀ACE抑制肽，将冷冻干燥后的粗河鲀ACE抑制肽加蒸馏入水中配制成0.8-1.2mg/mL的河鲀酶解液。

6.根据权利要求4所述的具有ACE抑制活性的河鲀多肽的制备方法，其特征在于，

所述步骤S2的具体步骤为：

对所述步骤S1制得的河鲀酶解液采用孔径为50-100μm的陶瓷膜进行澄清分离，然后采用50kDa、30kDa、10kDa、5kDa、1kDa的聚醚砜超滤膜对澄清的河鲀酶解液进行超滤处理，分别收集不同大小分子量的分离组分并冻干，测定各分离组分的ACE抑制率。