[发明专利]一种糜蛋白酶的提取纯化方法

说明书

本发明涉及一种糜蛋白酶的提取纯化方法。本发明采用硫酸溶液从动物胰脏中提取糜蛋白酶，经硫酸铵一次沉淀杂蛋白后进行疏水层析和亲和层析，具有工艺时间短，操作简便的优点。纯化过程可以使糜蛋白酶理化性质和生物活性保持稳定，最终使糜蛋白酶的各项指标均符合中国药典标准。通过工艺优化，糜蛋白酶效价提高到2700U/mg以上。

技术领域

本发明属于蛋白质的提取纯化领域，具体涉及一种糜蛋白酶的提取纯化方法。

背景技术

糜蛋白酶又称胰凝乳蛋白酶，系从牛或猪胰中提取的一种蛋白酶，属于丝氨酸肤链内切酶，其催化中心内的专一性袋穴比较宽，并且完全由疏水侧链排列而成，因而能接纳庞大的芳香族氨基酸的侧链基团，主要作用于芳香族如酪氨酸、苯丙氨酸及脂肪族侧链较长的大体积疏水性氨基酸如甲硫氨酸等氨基酸形成的肤键。

糜蛋白酶可以分解炎症部位纤维蛋白的凝结物，促进血凝块、脓性分泌物及坏死组织的溶化分解，从而净化创面，使肉芽组织新生，促进伤口愈合。在国外，该药在眼科、皮肤科做临床局部应用己被肯定。国内临床上主要用于眼科手术，也可用于创口或局部炎症，以减少局部分泌和水肿。此外糜蛋白酶对腰椎间盘突出症、骨伤、皮肤慢性溃疡等疾病也有疗效。

糜蛋白酶的传统制备方法为结晶法，结晶法是先将胰脏进行酸提取，提取液进行分段盐析，除去含杂蛋白的上清夜，盐析得到的沉淀即为糜蛋白酶原粗品。后续步骤与结晶法相似，将粗品糜蛋白酶原再次分段盐析纯化后用胰蛋白酶激活，酶的活化液用硫酸铵低温结晶后透析、冻干后即得。多重结晶及分段盐析方法工艺复杂、试剂消耗量大、结晶耗时长，纯化效果差，而且糜蛋白酶比活和收率都不高。

由此可见，由此可见，提供一种工艺时间短、操作简便、成本低、纯化效果好的糜蛋白酶的提取纯化方法成为本领域技术人员亟待解决的技术问题。

发明内容

鉴于现有技术多采用多重结晶及分级盐析的操作来纯化糜蛋白酶，存在结晶时间长，盐析使用硫酸铵过多等缺点。本发明提供了一种糜蛋白酶的提取纯化方法，具体为：

(1)将动物胰脏绞碎成浆后，加入硫酸溶液进行提取，然后进行过滤并收集滤液1；

(2)在所述滤液1中加入硫酸铵进行沉淀，然后进行过滤并收集滤液2；

(3)将所述滤液2进行超滤浓缩后，得到浓缩液，在所述浓缩液中加入胰蛋白酶进行活化处理；

(4)将所述活化处理后的浓缩液上样至疏水层析柱，进行洗脱处理并收集洗脱流出液，得馏分1；

(5)将所述馏分1进行超滤换盐后，上样至亲和层析柱，进行洗脱处理并收集洗脱流出液，得馏分2；

(6)将所述馏分2进行超滤换盐后，冻干，得到糜蛋白酶成品。

优选的，所述加入硫酸溶液进行提取，具体为：

所述硫酸溶液浓度为0.05-0.1mol/L，所述硫酸溶液使用量为每kg胰脏加入1-1.5L，并进行搅拌提取，所述搅拌提取时间为8-10小时。

优选的，所述步骤(2)，具体为：

在所述滤液1中加入所述硫酸铵至饱和度为30-40％，静置6-8小时后进行过滤并收集所述滤液2。

优选的，在所述浓缩液中加入胰蛋白酶进行活化处理，具体为：

调节所述浓缩液pH为7.5-8.0，加入胰蛋白酶活化后，加等体积纯化水稀释。

优选的，在所述步骤(4)中：