[发明专利]O型FMDV衣壳蛋白-铁蛋白融合蛋白、蛋白笼纳米颗粒及其制备方法

说明书

本发明公开了O型FMDV衣壳蛋白‑铁蛋白融合蛋白、蛋白笼纳米颗粒及其制备方法。本发明将含有O型FMDV优势表位与铁蛋白片段的核苷酸序列串联，合成O型FMDV衣壳蛋白表位‑铁蛋白片段；然后与促溶标签和亲和标签EW29相连，得到EW29/促溶标签/O型FMDV衣壳蛋白表位‑铁蛋白片段，诱导、亲和纯化后即得O型FMDV衣壳蛋白‑铁蛋白融合蛋白。电镜结果显示，该融合蛋白形成了20～25 nm的蛋白笼纳米颗粒。本发明为进一步研制安全、有效的O型FMDV衣壳蛋白疫苗奠定了基础。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及O型FMDV衣壳蛋白-铁蛋白融合蛋白、蛋白笼纳米颗粒及其制备方法。

背景技术

通过DNA重组技术，融合蛋白已经很容易在原核表达系统（大肠杆菌）和真核表达系统（酵母和哺乳动物细胞）进行高效表达，其产物在生物和医学上得到了广泛应用，也促进了其快速发展。与真核表达系统相比，大肠杆菌由于易操作、廉价和产量高等优点，仍然是目前生产重组蛋白的主要宿主。但是，当大肠杆菌细菌系统表达重组蛋白时，有许多本身难以克服的缺点：1、重组蛋白往往以无活性的包涵体形式出现；2、缺乏真核细胞翻译后修饰（糖基化、磷酸化和乙酰化等）机制，得到的重组蛋白虽然在一级氨基酸序列正确，但在高级结构和构象上与天然蛋白相差较大，无活性或活性极差；3、宿主细胞（大肠杆菌）自身蛋白成为热原，难以除去，存在安全性，这些问题限制了原核表达的重组蛋白在实际中的进一步应用。鉴于此，选择更有效的亲和促溶性标签以期获得纯度高、可溶性好，活性强的重组蛋白至关重要。

来自蚯蚓（Lumbricus terrestris）半乳糖结合凝集素EW29 C-末端的半乳糖结合结构域，其分子量为14.5kDa，可以和亲和层析的常用介质琼脂糖的半乳糖残基可逆结合，是一个高效的亲和标签。同时，EW29蛋白本身有很好的可溶性，和其它外源蛋白融合表达时，可以促进外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性（Yabe R, Suzuki R, Kuno A, Fujimoto Z,Jigami Y and Hirabayashi J (2007) Tailoring a novel sialic acidbinding lectinfrom a ricin-B chain-like galactosebinding protein by natural evolution-mimicry. J Biochem 141, 389–399.）。

铁蛋白(Ferritin)几乎存在于藻类、细菌、高等植物和动物等所有生物体，是生物体生命所必需的。蛋白壳是由24个亚基以高度对称性方式组成的内空心结构，空心直径约为8nm，外直径约为12nm。研究发现铁蛋白在体外可以自组装，形成套袖样的蛋白笼纳米颗粒；同时，铁蛋白纳米笼可以将外源小分子蛋白装入其纳米笼内，从而有效降低小分子抗原的降解，提高抗原的有效浓度，还可以有效协助靶细胞对相应抗原的摄取、加工，显著增强抗原蛋白的抗原稳定性和免疫原性。因此，铁蛋白独特的结构及理化性质使其可以作为一种新型的抗原递呈纳米运送平台。

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由 FMD 疫病毒(FMDV)引起偶蹄动物感染的一种急性、热性、高度接触性传染病，FMDV 属于微 RNA病毒科口蹄疫病毒属成员，病毒基因组为单股正链 RNA，全长约为 8.5 kb，四种结构蛋白VP4（1A）、VP2（1B）、VP3（1B） 和VP1（1D）与 FMDV RNA 组装成为成熟的病毒粒子。FMDV 根据血清型特点的不同，可以分为A 型、O 型、C 型、南非 I 型、南非 II 型、南非 III 型和亚洲 I 型七个血清型。近年来研究表明，FMDV 空衣壳与完整病毒粒子具有相似的免疫学特征，能够引起与天然病毒粒子相似的抗体反应，而且安全性好不存在散毒风险，因此口蹄疫病毒（FMDV）衣壳蛋白以及衣壳蛋白上的表位对研究FMDV基因工程疫苗的重要意义。