[发明专利]一种检测人线粒体ATP6基因8993位点基因型的试剂盒及方法

说明书

一种检测人线粒体ATP6基因8993位点基因型的试剂盒，包括用于扩增线粒体ATP6基因8993位点的PCR引物和Taqman‑MGB探针。荧光定量PCR法是分子诊断领域应用最广泛的一种检测手段，该方法灵敏度高、操作简便，适合大规模的临床应用，特别是ABI公司的MGB探针技术在单核苷酸分型方面更是具有广阔的市场。MGB探针上的小沟结合物能够提高探针的Tm值，设计的比普通Taqman探针短，无背景荧光，而且具有能分辨一个碱基差异的能力，非常适合用于SNP分型检测。

技术领域

本发明涉及一种检测人线粒体ATP6基因8993位点基因型的试剂盒及方法，属于基因检测技术领域。

背景技术

Leigh综合征(Leigh syndrome,LS)是婴儿和儿童时期最常见的一种线粒体疾病，其特征是脑干、基底节、丘脑和脊髓的双侧对称性坏死性病变。LS的遗传方式包括常染色体隐性遗传，X连锁的隐性遗传和母系遗传，这是因为线粒体中的氧化磷酸化酶组成成分是由核基因组和线粒体基因组共同编码的。据国外研究资料，线粒体基因组突变约占Leigh综合征病因的10％。其中以点突变最为多见，极少数为插入和大片段的缺失所致，迄今已经报道了19种与Leigh综合征相关的线粒体基因突变。其中线粒体ATP6基因8993TG突变已被证实会导致中国人Leigh综合征，在产前诊断筛查线粒体病中有十分重要的意义。

目前常用的检测基因多态性的方法有DNA直接测序法、限制性片段长度多态性分析法(PCR-PFLP)、高分辨溶解曲线(HRM)、基因芯片、液相芯片法、荧光定量PCR法等。测序法是公认的基因突变检测的金标准，能够准确地显示可能存在的具体突变类型，但测序法所用的设备成本高、检测时间稍长、操作繁琐、灵敏度较低，而且结果判读复杂，对操作者要求较高，难以形成商业化的诊断产品。限制性片段长度多态性分析步骤繁多、灵敏度低，而且检测结果经常需要测序法确认，也不是适用于临床检测的简便有效的方法。高分辨溶解曲线是近年来兴起的一种检测基因突变、进行基因分型和SNP检测的新工具，可以迅速的检测出核酸片段中单碱基的突变。但是该方法难于筛查纯合突变，并且假阳性、假阴性较高，PCR条件苛刻，不能分型，而且检测结果需要测序法确认。基因芯片和液相芯片虽能准确区分具体的突变类型，但是其对设备要求高，难以大规模推广，多用于科研单位。

中华神经科杂志2003年2月第36卷第1期公开的《Leigh综合征的线粒体DNA突变分析》，其采用探针为mtDNA第1-740核苷酸的片段。且其结果判断依赖于以内切酶ApaⅠ酶切的结果，没有进行DNA测序进行最终判断，因此，使用该方法的引物是否达到检测的目的无法判断。因此，有必要设计一种检测线粒体8993位点基因型的试剂盒及检测方法。

发明内容

为克服上述现有技术中的不足，本发明目的在于提供一种检测人线粒体ATP6基因8993位点基因型的试剂盒及方法。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种检测人线粒体ATP6基因8993位点基因型的试剂盒，其特征在于：包括用于扩增线粒体ATP6基因8993位点的PCR引物和Taqman-MGB探针；

所述PCR引物包括：上游引物F：5′-GTTATTATCGAAACCATCAGCCT-3′；

下游引物R：5′-AGTAGGTGGCCTGCAGTAATGT-3′；

所述探针包括：Taqman-MGB探针PT:5′VIC-CAATAGCCCGGGCC-MGB-3′；

Taqman-MGB探针PG:5′FAM-CAATAGCCCTGGCC-MGB-3′。

优选的技术方案为：还包括PCR预混液，该PCR预混液中含有PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶、MgCl₂和dNTPs。