[发明专利]一种应用于双链DNA片段的纯化方法

权利要求书

1.一种应用于双链DNA片段的纯化方法，其特征在于，该方法通过一步层析完成，所用原料及运作参数如下：

层析系统：AKTA Pure150；

层析柱尺寸：21.2*150mm；

流速：3～6mL/min；

流动相A-平衡缓冲液、流动相B-上样洗脱液；

平衡：至基线平稳；

上样：80mL酶切产物；

Wash：2～4个CV；

线性洗脱：28％-83％(流动相B)洗23～28CV。

2.根据权利要求1所述的一种应用于双链DNA片段的纯化方法，其特征在于，所述层析柱所用填料为GE SOURCE 30Q，应用过程中流速高，稳定性好，其活性基团R-O-CH₂-CHOH-CH₂-O-CH₂-CHOH-CH₂-N+(CH₃)₃可以有效结合带负电荷的基团，平均粒径较小为30μm，保障了良好的分辨率。

3.根据权利要求1所述的一种应用于双链DNA片段的纯化方法，其特征在于，所述基线平稳具体至紫外值固定变化在0.5-1mAu。

4.根据权利要求1所述的一种应用于双链DNA片段的纯化方法，其特征在于，所述平衡缓冲液：p H 6.5，50mM Tris-HCl，1mM EDTA；所述上样洗脱液：pH 6.5，50mM Tris-HCl，1mMEDTA，2M NaCl。

5.根据权利要求4所述的一种应用于双链DNA片段的纯化方法，其特征在于，所述缓冲液的pH值都较高，形成了比核酸等电点pH高的环境，使得核酸带净负电荷，可被填料吸附，不同长度的核酸，核酸带电量不同，吸附强度不一，依次解离纯化分离。

6.根据权利要求1所述的一种应用于双链DNA片段的纯化方法，其特征在于，所述酶切产物为分子量相差3000bp之内的双链线性DNA分子。

7.根据权利要求1所述的一种应用于双链DNA片段的纯化方法，其特征在于，所述酶切产物经过超滤浓缩无菌化处理，并以PVDF滤膜去除内毒素；所述层析为阴离子交换层析，吸附核酸于填料上，经过洗脱，得到目的片段。

8.根据权利要求1所述的一种应用于双链DNA片段的纯化方法，其特征在于，所述层析过程后进行误差线性曲线的绘制，包括如下步骤：

先用nanodrop2000测定该双链DNA片段浓度，然后用TEbuffer稀释至10μg/mL，20μg/mL，50μg/mL，200μg/mL，500μg/mL，1000μg/mL五个浓度梯度，量取峰面积做线性曲线，所用原料及试剂如下：

层析柱：TSKgel DNA-NPR色谱柱；

试剂：流动相A-平衡缓冲液(20mM Tris-HCl，pH9.0)；

流动相B-洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH9.0)；

0-100％洗脱；

流速：1mL/min；

线性洗脱：0→55％B，22CV，55％-65％B，20CV。

9.根据权利要求7所述的一种应用于双链DNA片段的纯化方法，其特征在于，所述洗脱过程为通过核酸吸附强度的差异性，致使较小长度的核酸先脱落。

10.根据权利要求1所述的一种应用于双链DNA片段的纯化方法，其特征在于，所述Wash：4个CV；所述线性洗脱：32％-78％(流动相B)洗26CV。