[发明专利]一种应用于双链DNA片段的纯化方法

说明书

本发明提供了一种应用于双链DNA片段的纯化方法，属于生物化学与分子生物学技术领域。本发明的目的是要建立一套分离纯化相差3000bp之内的双链线性DNA分子的方法，以有利于后期的基因治疗领域的发展。本发明根据核酸分子在中性以及pH偏大情况下带负电荷的特性，采用阴离子交换层析，把核酸吸附在填料上，经过洗脱，即可得到目的片段；本发明通过工艺路径的优化将经酶切之后的双链DNA片段进行分离纯化，且可进行工艺放大，可在GMP条件下生产，有利于推进基因治疗行业的快速、规范发展。本发明针对目前少有对酶切之后的双链DNA片段分离纯化方法的现状，尤其是对于酶切后相差3000bp之内双链DNA片段的分离纯化的方案，提供了新的思路和简单有效的方法。

技术领域

本发明涉及生物化学与分子生物学技术领域，尤其涉及一种应用于双链DNA片段的纯化方法。

背景技术

质粒(plasmid)广泛存在于生物界，从细菌、放线菌、丝状真菌、大型真菌、酵母到植物，甚至人类机体中都含有。细菌质粒是细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体(或拟核)以外的闭合环状的双链DNA分子，大小可为1kb到200kb，具有自主复制能力，并能稳定表达所携带的遗传信息，是基因工程中最常用的载体。

目前已经有技术对分子量相差较大的质粒进行分离的工艺较为成熟，但是很少有对酶切之后的双链DNA片段进行分离纯化工艺探索与优化，尤其是对于酶切之后两个片段相差3000bp之内的质粒进行分离纯化，因而具有很好的探索及应用空间，以有利于后期的基因治疗领域的发展。

发明内容

本发明的目的是要建立一套能够简易完成分离纯化酶切之后分子量相差3000bp之内的双链线性DNA分子的方法，以有利于后期的基因治疗领域的发展。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种应用于双链DNA片段的纯化方法，该方法通过一步层析完成，所用原料及运作参数如下：

层析系统：AKTA Pure150；

层析柱尺寸：21.2*150mm；

流速：3～6mL/min；

流动相A-平衡缓冲液、流动相B-上样洗脱液；

平衡：至基线平稳；

上样：80mL酶切产物；

Wash：2～4个CV；

线性洗脱：28％-83％(流动相B)洗25CV。

本发明公布的技术方案可以通过工艺路径的方法将经酶切之后片段进行分离纯化，并且可完成工艺放大，同时达到GMP的条件。

进一步的，所述层析柱所用填料为GE SOURCE 30Q，该骨架采用聚苯乙烯，应用过程中流速高，稳定性好，其活性基团：R-O-CH₂-CHOH-CH₂-O-CH₂-CHOH-CH₂-N+(CH₃)₃，可以有效结合带负电荷的基团，平均粒径较小为30μm，分辨率较好。

进一步的，所述基线平稳具体至紫外值固定变化在0.5-1mAu。

进一步的，所述平衡缓冲液：PH 6.5，50mM Tris-HCl，1mM EDTA；所述上样洗脱液：PH 6.5，50mM Tris-HCl，1mM EDTA，2M NaCl。

进一步的，所述缓冲液pH值较高，并形成比核酸等电点pH高的环境，使得核酸带净负电荷，可被填料吸附。不同长度的核酸带电量不同，吸附强度不一，依次解离纯化分离。

进一步的，所述酶切产物为分子量相差3000bp之内的双链线性DNA分子。