[发明专利]合成寡糖衍生物作为抗博德特百日咳杆菌疫苗

说明书

本发明提供基于百日咳博德特氏菌脂寡糖末端五糖的合成寡糖片段，一种获得合成寡糖片段及其偶联物的方法。还提供含有此类糖缀合物的疫苗组合物，所述寡糖缀合物引发减少百日咳杆菌在鼻咽部定植的免疫应答。

技术领域

本发明提供基于百日咳博德特氏菌脂寡糖末端五糖的合成寡糖片段，一种获得合成寡糖片段及其偶联物的方法。这些寡糖缀合物具有免疫原性，对百日咳博德特氏杆菌在鼻咽的定植起免疫保护作用，可作为百日咳预防的药物成分。

本发明讲述了合成寡糖片段与适宜载体偶联组成的具有免疫原性的糖-蛋白偶联物，制备寡糖片段及其偶联物的方法，药物组合物，及其含有这种糖偶联物的疫苗组合物。这种糖-蛋白偶联物能特别有效地诱导产生抗百日咳脂寡糖抗体，这些抗体可特别有效地减少百日咳博德特氏菌在鼻腔的定植。这种新诱导产生的免疫作用在使用无细胞百日咳疫苗免疫后完全缺失，在用全细胞百日咳疫苗免疫接种后仅低水平存在。因此，本发明是对预防百日咳一个重要贡献。

本发明属于抗菌糖缀合物疫苗领域。

背景技术

百日咳是一种由博德特氏杆菌引起的一种急性呼吸道高度传染性疾病，婴幼儿为主要传染对象。自1950年代以来，针对这种疾病的疫苗一直在使用，全球疫苗接种覆盖率已经达到85％以上。全细胞百日咳疫苗的高免疫反应，以及对作为主要保护性抗原的百日咳毒力因子分子作用机制深入理解，促成了无细胞百日咳疫苗的诞生¹。然而，这种疾病在任何国家都没有得到控制，甚至在工业化国家也出现了惊人的逆转，在工业化国家第一代全细胞疫苗已经被更新的、副反应小的无细胞百日咳疫苗所取代。这种疫苗可预防疾病出现逆转的诸多原因中包括疫苗的免疫诱导能力逐渐减弱、百日咳杆菌菌株的遗传突变以及一直存在的感染后带菌人群的无症状传播。虽然对发展中国家百日咳疫苗接种后的保护期知之甚少,几项研究表明工业化国家的免疫保护在接种4到12年后开始消退²。百日咳疾病报告在较大的儿童、青少年和成年人中越来越多。在美国的一项血清学研究表明，21％(95％置信区间[13-32％])的长时间咳嗽(持续2周)成年人患有百日咳³。

青少年和成人是把百日咳博德特氏菌传播到未接种疫苗婴幼儿的主要传播源。在加拿大、法国、德国和美国进行的一项研究表明，婴儿百日咳病例中76-83％的感染⁴，源自其家庭成员(主要是父母)的传染。非人灵长类动物的研究表明，无论是全细胞还是无细胞疫苗都不能阻止百日咳杆菌的传播。发病率数据模型研究表明无症状传播是疫苗接种人群百日咳复发的主要原因⁵。

对于荚膜多糖病原体，如b型流感嗜血杆菌、肺炎链球菌或脑膜炎奈瑟菌，鼻咽部传染也是感染的先决条件和传播源。以多糖-蛋白为基础的结合疫苗能在局部粘膜诱导高度免疫反应，在降低传染过程中起着至关重要的作用⁶。对于非荚膜细菌而言，由于脂多糖(LPS)中的糖大部分在外膜上暴露出来，这些糖类化合物及针对这些糖类化合物免疫应答可发挥类似的作用⁷。就百日咳博德特氏杆菌而言,针对其非荚膜细菌核心寡糖的免疫球蛋白G抗体显示出对人体的保护作用，同时可以引发补体依赖的细菌杀灭^8,9,10。在百日咳博德特氏杆菌中，脂多糖也称为脂寡糖，具有非常短的寡糖链。寡糖是具有独特结构的支链化十二糖(图1)，但脂寡糖本身免疫原性低。脂寡糖可以在酸性条件下水解并分离纯化，进而与载体蛋白结合以提供更好的脂寡糖免疫原性¹¹。这种缀合物能诱导小鼠的杀菌抗体。通过拆解百日咳博德特氏杆菌寡多糖,进一步改进脂寡糖结构的杀菌活性，得到了末端五聚糖¹²。它们的蛋白缀合物可重现上述十二糖蛋白缀合物的杀菌活性。

天然的脂寡糖存在两种不同的寡糖结构形式，经电泳分离后被称为带-A(完整十二糖结构)和带-B(缺少末端三糖的九糖结构)¹³，也被间接用于增进对杀菌抗体特异性的理解。例如，七种针对百日咳全细胞单克隆抗体是脂寡糖特异的。其中五种还表现出强抗脂寡糖杀菌活性。这些单克隆抗体对各种百日咳细胞都显示强的识别和杀菌性能,但仅有含带-B脂寡糖结构的博德特氏百日咳菌株134除外。