[发明专利]一种Mnep单体变体及其应用

说明书

本发明提供了一种包含SEQ ID NO：1第92‑104位任意一个或多个氨基酸突变的氨基酸序列的Mnep单体变体、以及包含至少一个Mnep单体变体的孔蛋白或构建体及其用途。本发明还提供了一种表征目标多核苷酸的方法。

技术领域

本发明涉及核酸特性的表征技术领域，具体涉及一种Mnep单体变体、包含Mnep单体变体的孔蛋白及构建体，及应用所述Mnep单体变体或孔蛋白进行表征目标多核苷酸的方法。

背景技术

纳米孔测序技术是一种以单链核酸分子作为测序单元，利用一个能够提供离子电流通道的纳米孔，使得单链核酸分子在电场力驱动下通过该纳米孔，当多核苷酸通过纳米孔易位时，会由于物理占位效应而产生相对应的阻塞电流，对产生的不同信号实时读取进而分析得到多核苷酸序列信息的基因测序技术。纳米孔测序技术具有以下优势：在无需扩增的情况下，即可简便的建库；阅读速度快，单链分子的阅读速度能够达到每小时数万个碱基；阅读长度更长，通常可以达到数千个碱基；可以直接进行甲基化等修饰的DNA或RNA的测量。

但是，每一个或一系列核苷酸在电场力的作用下通过纳米孔蛋白时，会产生一种特定的阻塞电流，此时记录的电流信号与多核苷酸的序列虽是对应关系，却通常是3-4个或更多个核苷酸控制某些级别的电流水平，所以仍然需要提高精确度。目前，可以通过改变多核苷酸结构、在纳米孔处的持续时间以及开发新的纳米孔从而控制多核苷酸的易位来提高精确度。

例如：专利WO2013057495A3公开了一种新的表征目标多核苷酸的方法，所述的方法使用孔和Hel308解旋酶或能结合目标多核苷酸内部核苷酸的分子马达。该发明所述的解旋酶或分子马达可以有效控制目标多核苷酸穿过所述孔的运动。

专利CN102216783B公开了一种耻垢分枝杆菌孔蛋白(Msp)纳米孔以及使用该纳米孔进行测序，其中，将野生型Msp的90或91位点突变以提高分析物在测序时的电导，并降低分析物在测序中的转位速度。

专利CN103460040A公开了一种突变型的Msp单体，以及其在纳米孔测序中的应用。该突变型的Msp单体在纳米孔测序中显示出了更强的不同核苷酸之间的区分能力。

然而，现有技术中并未提到Mnep单体变体及在测序中的应用，且现有技术中可以用于测序的孔蛋白种类很少。

因此，本发明进一步提供了一种新的纳米孔蛋白，通过将不能被用于测序的Mnep单体野生型蛋白进行突变制备了Mnep单体变体，并证实了该Mnep单体变体在测序中的功能。

发明内容

本发明证明了制备Mnep突变型蛋白特定位点突变的Mnep单体变体，可以用于纳米孔测序，然而Mnep单体野生型并没有该功能。并且，应用本发明所述的孔蛋白进行纳米孔测序，可以明显的看出各种不同核苷酸电流信号的差别，具备较高的测序精确度。

本发明所述的“Mnep”来源于新金色分枝杆菌。优选的，所述的“Mnep”来源于Mycobacterium neoaurum。

具体的，本发明的第一方面，提供了一种Mnep单体变体，所述的Mnep单体变体包含SEQ ID NO：1第92-104位任意一个或多个氨基酸突变的氨基酸序列。

优选的，所述的变体包含第92位甘氨酸(G)的突变、第93位天冬氨酸(D)的突变、第95位甘氨酸(G)的突变或第104位丙氨酸(A)的突变中的一种或两种以上的组合。

进一步优选的，所述的变体包含如下突变的一种：