[发明专利]带有电荷标签的核苷酸及其使用方法

说明书

本发明提供一种方法，其包括检测被标记的核苷酸通过聚合酶向与模板多核苷酸链互补的新生多核苷酸链中的掺入，其中所述聚合酶通过系链而被栓系到固体载体导电通道，所述被标记的核苷酸是式I的化合物。

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年2月16日提交的美国临时专利申请号62/710,327、2018年2月16日提交的美国临时专利申请号62/710,333、2018年2月16日提交的美国临时专利申请号62/710,362，2018年2月16日提交的美国临时专利申请号62/710,461的优先权；所有这些申请的全部内容通过引用合并于此。

背景技术

当前，大多数测序平台使用“边合成边测序”(SBS)技术和基于荧光的检测方法。作为对SBS的补充，期望允许更成本有效、快速、以及方便测序和核酸检测的替代测序方法。基于电荷的测序是一种有吸引力的方法。

当前的边合成边测序(SBS)技术使用在两个位置处被经修饰核苷酸：1)脱氧核糖的3'-羟基(3'-OH)、以及2)含氮碱基(A、T、C、G)的嘧啶的5-位或嘌呤的7-位。3'-OH基团用叠氮基甲基封端，以生成可逆核苷酸终止子。这可以防止添加单个核苷酸后的进一步延伸。每个含氮碱基分别用荧光团修饰，以提供标识单个碱基掺入的荧光读出。接着，将3'-OH封端基团和荧光团去除，并且重复循环。

由于修饰脱氧核糖的3'-OH和含氮碱基的合成挑战，当前修饰核苷酸的成本可能很高。有几种可能的方法可以降低修饰核苷酸的成本。一个方法是代替含氮碱基，将读出标签移动到5'-末端磷酸酯。在一个示例中，这不需要单独的剪切步骤，并且允许实时检测新进入的核苷酸。在掺入过程中，焦磷酸酯与标签一起作为延伸过程的副产物释放，因此不涉及可剪切的键。

发明内容

本文提供的示例包括一种用于检测通过聚合酶掺入新生多核苷酸链中的核苷酸的方法、和用于所述方法的组合物。本文提供的一个示例是一种用于利用导电通道检测在该掺入过程中带有带电标签的核苷酸的方法；以及具有该带电标签的该核苷酸的化合物。一个示例提供了具有电荷标签的核苷酸，其包括磷酸二酯基、氨基酸、树状物结构和其他增强电荷密度的构架结构；将核苷酸连接至电荷密度增强的电荷标签的方法；以及使用具有电荷密度增强的电荷标签的核苷酸的方法。

在一个方面，提供了一种方法，其包括检测被标记的核苷酸通过聚合酶向与模板多核苷酸链互补的新生多核苷酸链中的掺入，其中所述聚合酶通过系链而被栓系(tether)到固体载体导电通道，所述被标记的核苷酸是式I的化合物，

其中，n是3至10的整数，m是1至10的整数，t是0至50的整数，X₁是直接键、C₁-C₁₀烷基、C₁-C₁₀氧杂烷基、C₁-C₁₀硫杂烷基或C₁-C₁₀氮杂烷基，X₂是C₁-C₂₀烷基，其中任选一个或多个单独的CH₂残基被肽键和(-O-CH₂-CH₂-)_a中的一个或多个替代，其中a是1至24的整数，X₃是直接键或寡核苷酸，其中当所述标记靠近所述导电通道时，所述寡核苷酸与所述系链的受体区域杂交，F₁选自荧光团和直接键，且F₂不存在或为荧光团，

A是或酰胺键，且

Y选自

q是1至100的整数，并且

B选自氨基酸、核苷酸、其中各R选自Y、氢、和树状物；并且，其中当B是树状物时，q等于1，并且q数量个B具有电荷和电荷密度，并且

所述导电通道用于在掺入过程中检测被标记的核苷酸。