[发明专利]使用感染因子快速检测沙门氏菌属的方法和系统

说明书

本文公开了快速检测样品中的微生物的方法和系统。还公开了在晚期基因区内包含指示基因的经遗传修饰的噬菌体。噬菌体诸如沙门氏菌属特异性噬菌体的特异性允许检测特定微生物，诸如沙门氏菌属种，并且可以放大指示信号以优化测定灵敏度。

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年1月12日提交的美国临时申请第62/616,956号、2018年2月9日提交的第62/628,616号以及2019年4月24日提交的第62/661,739号的优先权。美国申请第13/773,339号、第14/625,481号、第15/263,619号、第15/409,258号以及美国临时申请第62/616,956号、第62/628,616号和第62/661,739号的公开内容在此通过引用整体并入本文。

发明领域

本发明涉及使用感染因子检测微生物的组合物、方法、系统和试剂盒。

背景

人们对提高检测生物、食品、水和临床样品中细菌、病毒和其他微生物的速度和灵敏度非常感兴趣。微生物病原体可导致人和家畜的大量死亡，以及巨大的经济损失。此外，鉴于因摄入被某些微生物(例如沙门氏菌属种(Salmonella spp.))污染的食物而导致的威胁生命或致命疾病的爆发，检测微生物是食品与药物管理局(FDA)、美国农业部(USDA)以及疾病控制中心(CDC)关注的高度优先级事项。

用于检测细菌的常规微生物检验依赖于非选择性和选择性富集培养，随后在选择性培养基上进行铺板，并进一步检验以确认可疑菌落。此类程序可能需要几天时间。已经研究了多种快速方法并将其引入实践中以减少时间需求。然而，这些方法有缺点。例如，涉及直接免疫测定或基因探针的技术通常需要过夜富集步骤以获得足够的灵敏度。聚合酶链式反应(PCR)测试也包括扩增步骤，因此能够具有非常高的灵敏度和选择性；然而，能够经济地进行PCR检验的样品量是有限的。对于稀的细菌悬浮液，大多数小的子样品将不含细胞，因此仍然需要纯化和/或长时间的富集步骤。

常规生物富集所需的时间由样品中目标细菌群体的生长率、样品基质的作用和所需的灵敏度决定。实际上，大多数高灵敏度方法采用过夜孵育，总共需要约24小时。由于培养需要时间，因此这些方法可能花费三天时间，这取决于待鉴定的生物体和样品的来源。这种滞后时间通常是不合适的，因为受污染的食物、水或其他产品可能已经进入牲畜或人体内。另外，抗生素抗性细菌和生物防御因素的增加使得快速鉴定水、食品和临床样品中的细菌病原体成为全球的关键优先级事项。

因此，需要更快速、简单和灵敏地检测和鉴定微生物，诸如细菌和其他潜在的病原性微生物。

发明内容

本发明的实施方案包括用于检测目标微生物诸如沙门氏菌属种(Salmonellaspp.)的组合物、方法、系统和试剂盒。本发明可以以多种方式实施。

在一些方面，本发明包括重组噬菌体，其包含插入噬菌体基因组的晚期基因区中的指示基因。在一些实施方案中，重组噬菌体是经遗传修饰的沙门氏菌属特异性噬菌体基因组。在某些实施方案中，重组噬菌体是经遗传修饰的噬菌体基因组。在一些实施方案中，用于制备重组噬菌体的噬菌体特异性感染沙门氏菌属种。在一个实施方案中，重组噬菌体可以在其他类型的细菌存在的情况下区分出沙门氏菌属的种。

在重组指示噬菌体的一些实施方案中，指示基因可以是密码子优化的，并且可以编码产生内在信号的可溶性蛋白质产物或在与底物反应时产生信号的可溶性酶。一些重组噬菌体还包含密码子优化的指示基因上游的非翻译区，其中所述非翻译区包括噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点。在一些实施方案中，指示基因是萤光素酶基因。萤光素酶基因可以是天然存在的基因，诸如刺虾(Oplophorus)萤光素酶、萤火虫萤光素酶、Lucia萤光素酶或海肾萤光素酶，或者其可以是经遗传工程改造的基因，诸如