[发明专利]用于表征蛋白质二聚化的系统和方法

权利要求书

1.一种用于鉴别蛋白质药物产品中的非共价相互作用位点或二聚化界面的方法，包括：

在原生条件下采用对蛋白质药物产品的有限消化以形成包含单体和非共价连接的二聚体的蛋白质药物二聚体样品混合物；

将可检测的修饰引入所述蛋白质药物二聚体样品混合物的所述二聚体和单体中以产生经修饰的二聚体和经修饰的单体；

使用原生尺寸排除色谱将所述经修饰的二聚体和经修饰的单体分离成经修饰的二聚体级分和经修饰的单体级分；

消化所述经修饰的二聚体级分和所述经修饰的单体级分以形成肽样品；

使用液相色谱/质谱(LC-MS)分离所述肽样品以获得所述肽样品的质谱数据；

通过计算所述蛋白质药物产品的每种肽和经修饰肽的质量，使用所述肽的所述质谱数据与所述蛋白质药物产品的已知质量数据进行比较，确定所述肽样品中的每种肽的修饰位点。

2.根据权利要求1所述的方法，其中原生有限消化条件可保留多肽之间的二硫键和二聚体之间的非共价相互作用。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中通过快速光化学氧化来修饰所述二聚体和单体以使可检测的氧化修饰形成于所述二聚体和单体中。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述蛋白质药物产品包含抗体或其抗原结合片段、重组蛋白、融合蛋白或它们的组合。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述蛋白质药物产品是抗体，并且所述混合物中的所述二聚体基本上由两个相互作用的F(ab’)或F(ab)片段组成。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述蛋白质药物产品是抗体，并且所述混合物中的所述单体基本上由F(ab)片段和Fc片段组成。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述修饰是氨基酸侧链修饰。

8.根据权利要求4-7中任一项所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体、双特异性抗体或它们的抗原结合片段。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中使用包含乙酸铵和碳酸氢铵的流动相进行所述原生尺寸排阻色谱。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中使用反相液相色谱分离所述消化的蛋白质样品。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述修饰选自氧化、二氧化、三氧化、犬尿氨酸、脱硫甲基、脱羧化、羟基犬尿氨酸以及它们的组合。

12.根据权利要求1或2所述的方法，其中用酶消化所述蛋白质药物产品。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述酶选自木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、内切蛋白酶Lys-C和IdeS或它们的经修饰形式。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述经修饰的二聚体级分和经修饰的单体级分是通过可破坏连接两个连续氨基酸残基的共价化学键的酶消化而形成肽。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述蛋白质药物产品样品来自补料分批培养物、纯化处理步骤或配制药物物质。