[发明专利]用于表征蛋白质二聚化的系统和方法

说明书

提供了在蛋白质的亚结构域水平上表征二聚化界面的系统和方法。示例性方法包括将蛋白质二聚体样品消化成亚结构域、标记所述消化的蛋白质样品、分离标记的二聚体亚结构域片段和单体亚结构域片段以及对所述标记的样品进行肽作图以确定所述二聚体片段被标记的位置和所述二聚体片段未被标记的位置。二聚体级分与单体级分相比显示出标记程度降低的区域可能与所述二聚化界面有关或非常接近。

相关专利申请的交叉引用

本申请要求于2018年2月2日提交的美国临时专利申请No.62/625,732和于2018年9月28日提交的美国临时专利申请No.62/738,051的优先权，将这两个美国临时专利申请的全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明整体涉及用于表征蛋白质及其片段中的非共价相互作用位点的分析方法和系统。

背景技术

在过去的20年中，单克隆抗体(mAb)已经成功地用于靶向各种治疗领域(WalshG.,Nature biotechnology 2014；32:992-1000；Lawrence S.Nature biotechnology2007；25:380-2)。蛋白质聚集仍然是单克隆抗体和其他治疗性蛋白质制备中的主要问题。由于对效力和免疫原性的潜在影响，理解聚集机制非常重要，以使得可实施适当的控制策略来确保产品品质。

由于mAb二聚体的复杂性和异质性，对mAb分子中的二聚化界面进行作图仍然具有挑战性。尽管氢-氘交换质谱(HDX MS)已经成功地研究了蛋白质-蛋白质相互作用，但在揭示mAb二聚化界面方面几乎没有取得成功，这可能是由于检测蛋白质侧链相互作用的方法局限性。

因此，本发明的目的是提供用于对蛋白质的异质二聚化界面进行作图的系统和方法。

本发明的另一个目的是提供二聚化水平降低的蛋白质药物产品。

本发明的另一个目的是提供制备二聚化减少的蛋白质药物产品的方法。

发明内容

本发明提供在蛋白质的肽/残基水平上表征蛋白质二聚化界面的系统和方法。示例性方法包括将蛋白质二聚体样品消化成亚结构域，标记经消化的蛋白质样品混合物，分离标记的二聚体亚结构域片段和单体亚结构域片段，以及对标记的样品进行肽作图以确定并比较二聚体中和单体中的标记程度。二聚体级分与单体级分相比显示出标记程度降低的区域可能与二聚化界面有关或非常接近。

在一个实施方案中，分离非共价二聚体并通过肽作图分析以定位非共价相互作用位点。在用以在肽/残基水平上定位非共价二聚化界面的另一个实施方案中，将富集的mAb二聚体样品消化成F(ab)[或F(ab')]同型二聚体、F(ab)[或F(ab')]单体和Fc单体的混合物，并使其接受标记实验，随后进行分级分离、胰蛋白酶消化和LC-MS分析，用于肽/残基水平上的标记程度量化和比较。下文提供所公开的方法的步骤的更多细节。