[发明专利]CRM197蛋白质表达

说明书

本发明关于在细胞中生产CRM197重组蛋白质的方法。该方法包括培养包含具有多核苷酸的表达质粒的细胞，并诱导该CRM197蛋白质的表达。

相关申请的交互引用

本申请主张于2018年1月19日申请的美国临时申请案62/619,449的权益，该临时申请案的全部内容透过引用并入。

技术领域

本公开内容涉及细菌宿主中生产重组蛋白质的领域。特别是，本发明涉及自细菌细胞中获得折叠良好的可溶性重组CRM197蛋白质的方法。本公开内容还涉及该重组CRM197蛋白质的表达质粒及宿主细胞。

背景技术

白喉毒素(Diphtheria toxin,DT)是一种蛋白质性外毒素，其由病原体，例如，白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)所合成。产毒菌株含有携带该毒性基因的噬菌体溶素原。白喉毒素(DT)被合成为535个氨基酸的多肽，其含有透过二硫键连接在一起的片段A(催化结构域)以及片段B(受体结合及跨膜结构域)。该毒素与细胞受体(HB-EGF-受体)结合并透过胞吞作用进入该细胞，其中该片段A透过蛋白质水解切割而自该片段B释放。片段A可以透过在哺乳动物延伸因子2(elongation factor 2,EF-2)中在组氨酸715处催化ADP-核糖基转移至白喉酰胺(diphthamide)的N-1而抑制蛋白质翻译。因此，白喉毒素(DT)可透过与细胞表面受体结合，进入胞质溶胶，并使核糖体延伸因子2(EF-2)失活而杀死真核细胞。

交叉反应材料197(cross-reacting material 197,CRM197)的基因由突变噬菌体β197^tox-携带。CRM197为一种无毒形式的白喉毒素，其含有谷氨酸到甘氨酸(G52E)的单个氨基酸取代并丧失其ADP-核糖基转移酶活性但保留结合活性。CRM197通常用作多糖或寡糖结合型疫苗中的载体。其为一种针对荚膜细菌的结合型疫苗的理想载体。包含与不良免疫原性及T细胞非依赖性荚膜多糖共价缀合的CRM197的结合型疫苗产生高度免疫原性并导致对该抗原长期免疫性的接合抗原。其已被广泛用作几种疫苗中的载体蛋白质，例如，Hib疫苗(Novartis Vaccines公司)，七价及13价肺炎球菌疫苗(Wyeth公司)以及脑膜炎球菌血清群C结合型疫苗(Novartis Vaccines公司与Wyeth公司)。最近的研究显示，CRM197可以抑制肝素结合表皮生长因子(heparin-binding epidermal growth factor,HB-EGF)，这是一种表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)配体。EGFR及其配体参与细胞发育、增殖及分化，并可诱导肿瘤形成。

总之，CRM197为一种结合型疫苗中常用的载体蛋白质。其高纯度、均质的结构以及赖氨酸残基的可用性，能够生产出定义明确且具有特征的糖复合疫苗。CRM197的这些具吸引人的特征已被用于开发各种具有已被证实免疫原性的基于CRM197的结合型疫苗。

发明内容

于本申请中，提供了一种新方法来产生适当折叠的可溶性CRM197蛋白质，其形成具有正确的二硫键，例如，2个内二硫键。

在一方面，本文提供了一种产生CRM197蛋白质的方法。该方法包括培养包含具有多核苷酸的表达质粒的细菌细胞的步骤；并诱导该CRM197蛋白质的表达。该多核苷酸包含：(a)与SEQ ID NO:1至少90％相同的CRM197核苷酸序列，以及(b)分泌信号序列，于该CRM197核苷酸序列的5’端编码SEQ ID NO:2的氨基酸。

优选地，该分泌信号序列可为果胶酸裂解酶B(pectate lyase B,PelB)序列。更优选地，该PelB序列来自欧文氏菌属种(Erwinia spp.)。

优选地，该表达质粒可包含磷酸盐调节的启动子。更优选地，该磷酸盐调节的启动子可为细菌性碱性磷酸酶A启动子。