[发明专利]用于解卷积分区条码的方法和组合物

说明书

提供了评估分区中是否存在多个差异性条码引物的方法。

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年1月31日提交的美国临时专利申请号62/624,400的优先权，该申请通过引用纳入本文用于所有目的。

背景技术

偶联寡核苷酸的珠被用于微流体检测应用，诸如具有许多不同分区(例如，液滴)的高通量测序。为了独特地鉴定各分区，可以用独特的条码序列标记珠。然而，为了确保分区仅有一个珠并因此被条码所独特地标记，通常调整珠浓度以使仅有约十分之一的分区被珠所占据。这导致分区的低利用率，并且增加检测样品所需的试剂以及样品的量。增加珠浓度将导致较高的分区占用率以及更大的分区利用率。检测样品所需样品和试剂的量将减少。相反地，较高的珠浓度将导致更多数量的分区具有超过一个珠。因此，一些划分的样品将被超过一个条码标记。在一些情况中，样品在超过一个条码之间被分割，这导致各条码灵敏度的损失。

发明概述

在一些实施方式中，提供了检测分区中多个条码存在与否的方法。在一些实施方式中，该方法包括，

形成分区，所述分区包含：正向引物，其包含条码和捕获序列，所述捕获序列与以下互补：靶核酸的3′序列，或其反向互补序列，其中不同分区包含具有不同条码序列的不同正向引物，以及分区ID标签寡核苷酸，所述分区ID标签寡核苷酸包含所述捕获序列的反向互补序列和可变分区ID标签序列；

在所述分区中，使至少一个正向引物与所述分区ID标签寡核苷酸杂交以形成杂交产物；

对所述杂交产物进行扩增以形成扩增子，其中至少一些扩增子由正向引物和所述分区ID标签寡核苷酸形成；和

对所述扩增子进行测序，其中如果不同的正向引物与相同可变分区ID标签序列形成扩增子，那么认为所述不同的正向引物来自同一分区，其中

所述正向引物和所述分区ID标签寡核苷酸在递送至所述分区时与同一底物连接；或

所述分区ID标签寡核苷酸具有封端3′端，从而使聚合酶在扩增期间无法延伸所述封端3′端；或

所述分区ID标签寡核苷酸包含双链可变分区ID标签序列和一个或两个单链3′端，所述单链3′端包含所述捕获序列的反向互补序列。

在一些实施方式中，正向引物、分区ID标签寡核苷酸或两者包含通用衔接子序列。

在一些实施方式中，至少一些分区包含靶核酸。在一些实施方式中，扩增还使用正向引物和靶反向引物扩增靶核酸以形成扩增产物，并且所述测序包括对所述扩增产物进行测序。

在一些实施方式中，扩增包括使用分区ID标签寡核苷酸作为模板用聚合酶延伸正向引物以形成扩增子，其包含分区ID标签寡核苷酸的反向互补序列和正向引物。

在一些实施方式中，在所述分区形成步骤中，正向引物连接珠。在一些实施方式中，分区ID标签寡核苷酸的多个拷贝彼此连接。在一些实施方式中，多个拷贝通过珠彼此连接。在一些实施方式中，在分区形成期间，所述正向引物和所述分区ID标签寡核苷酸通过可切割接头彼此连接，并且所述方法还包括在所述扩增之前切割所述可切割接头。在一些实施方式中，相较于连接珠的分区ID标签寡核苷酸，所述珠包含至少10(例如，100、1000、10000)倍数量的正向引物。

在一些实施方式中，在扩增前从所述珠切割引物。

在一些实施方式中，所述分区ID标签寡核苷酸是单链的。

在一些实施方式中，可变分区ID标签序列是双链的。在一些实施方式中，双链可变分区ID标签序列各条链的3′端与捕获序列的互补序列连接。

在一些实施方式中，在所述分区形成步骤期间，分区ID标签寡核苷酸与固体支持物连接。