[发明专利]用于单分子测序的单链环状DNA模板的产生

权利要求书

1.分别对靶核酸的每条链进行测序的方法，该方法包括以下步骤：

a)在反应混合物中，将双链靶核酸的末端接合至衔接子以形成双衔接的靶核酸，其中所述衔接子是形成双链茎和单链环的单链，并且所述茎包含至少一个链切割位点；

b)使所述反应混合物与核酸外切酶接触，从而富集所述双衔接的靶核酸；

c)使所述反应混合物与切割剂接触以在所述切割位点切割所述双衔接的靶核酸，在每条链上形成可延伸的末端；

d)延伸所述可延伸的末端，从而分别对所述靶核酸的每条链进行测序，其中延伸终止于所述切割位点，并且不进行到互补链上。

2.权利要求1的方法，其中接合至衔接子是通过连接。

3.权利要求1的方法，其中所述衔接子包含至少一个条形码。

4.权利要求1的方法，其中所述切割位点包含一个或多个脱氧尿嘧啶，并且所述切割剂包括尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶(UNG)和核酸内切酶。

5.权利要求1的方法，其中所述衔接子包含核酸外切酶保护核苷酸。

6.权利要求1的方法，其中所述衔接子包含捕获部分的配体。

7.权利要求1的方法，进一步包括在测序之前的靶富集步骤。

8.权利要求15的方法，其中所述富集是通过经由靶特异性探针捕获。

9.制备用于分别对靶核酸的每条链进行测序的靶核酸的文库的方法，所述方法包括以下步骤：

a)在反应混合物中，将双链靶核酸的末端接合至衔接子以形成双衔接的靶核酸，其中所述衔接子是形成双链茎和单链环的单链，并且所述茎包含链切割位点；

b)使所述反应混合物与核酸外切酶接触，从而富集所述双衔接的靶核酸；

c)使所述反应混合物与切割剂接触以在所述切割位点切割所述双衔接的靶核酸，在每条链上形成可延伸的末端。

10.确定样品中靶核酸的文库的序列的方法，所述方法包括以下步骤：

a)通过权利要求9的方法制备靶核酸的文库；

b)延伸所述可延伸的末端，从而分别对所述文库中的所述靶核酸的每条链进行测序，其中所述延伸终止于所述切割位点并且不进行到互补链上。

11.分别对靶核酸的每条链进行测序的方法，该方法包括以下步骤：

a)在反应混合物中，将双链靶核酸的末端接合至衔接子以形成双衔接的靶核酸，其中所述衔接子是形成双链茎和单链环的单链，并且所述环包含引物结合位点，并且所述衔接子进一步包含链合成终止位点，以及；

b)使所述反应混合物与核酸外切酶接触，从而富集所述双衔接的靶核酸；

c)使所述反应混合物与引物接触，所述引物能够与所述引物结合位点杂交；

d)延伸所述引物，从而分别对所述靶核酸的每条链进行测序，其中延伸终止于所述链合成终止位点，并且不进行到互补链上。

12.权利要求12的方法，其中所述链合成终止位点选自切口、缺口、无碱基核苷酸和非核苷酸接头。

13.制备用于分别对靶核酸的每条链进行测序的文库的方法，该方法包括以下步骤：

a)在反应混合物中，将双链靶核酸的末端接合至衔接子以形成双衔接的靶核酸，其中所述衔接子是形成双链茎和单链环的单链，并且所述环包含引物结合位点，并且所述衔接子进一步包含链合成终止位点；

b)使所述反应混合物与核酸外切酶接触，从而富集所述双衔接的靶核酸，并且形成双衔接的靶核酸的文库。

14.确定样品中靶核酸的文库的序列的方法，所述方法包括以下步骤：

a)通过权利要求13的方法形成靶核酸的文库；

b)使所述文库与引物接触，所述引物能够与所述引物结合位点杂交；

c)延伸所述引物，从而分别对所述文库中的所述靶核酸的每条链进行测序，其中延伸终止于所述链合成终止位点并且不进行到互补链上。