[发明专利]用于单分子测序的单链环状DNA模板的产生

说明书

本发明是分别对核酸的每条链进行测序的新方法，其涉及使用包含链切割位点或链合成终止位点的衔接子。衔接子也可以在链切割位点自引发。

发明领域

本发明涉及核酸分析领域，并且更具体地，涉及制备用于核酸测序的模板。

发明背景

单分子核酸测序包括制备用于测序步骤的靶分子的文库的步骤。线性核酸文库通常与阻碍测序方法性能的线性核酸副产物共存。存在产生环状双链模板的文库制备方法，所述模板允许靶序列的两条链在连续聚合酶读取中被读取多次。参见美国专利号7,302,146和8,153,375。一些应用需要读取长的靶分子，使得分别单程读取或每条链是更理想的。本发明是有效产生文库并分别对靶核酸的每条链进行测序的方法。该方法具有以下详细描述的多个优点。

发明概述

在一些实施方案中，本发明是分别对靶核酸的每条链进行测序的方法，该方法包括以下步骤：在反应混合物中，将双链靶核酸的末端接合至衔接子以形成双衔接的靶核酸，其中所述衔接子是形成双链茎和单链环的单链，并且所述茎包含至少一个链切割位点；使所述反应混合物与核酸外切酶接触，从而富集所述双衔接的靶核酸；使所述反应混合物与切割剂接触以在所述切割位点切割所述双衔接的靶核酸，在每条链上形成可延伸的末端；延伸所述可延伸的末端，从而分别对所述靶核酸的每条链进行测序，其中延伸终止于所述切割位点，并且不进行到互补链上。所述接合可以通过例如靶核酸和衔接子的粘端的连接来进行。所述核酸外切酶可以选自核酸外切酶III和核酸外切酶VII之一或两者。所述衔接子可以包含至少一个条形码。在一些实施方案中，所述切割位点包含一个或多个脱氧尿嘧啶，并且所述切割剂包括尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶(UNG)和核酸内切酶，例如核酸内切酶III、核酸内切酶IV或核酸内切酶VIII。在一些实施方案中，所述切割位点包含一个或多个核糖核苷酸，并且所述切割剂包括RNA酶H。在一些实施方案中，所述切割位点包含一个或多个无碱基位点，并且所述切割剂包括选自核酸内切酶III、核酸内切酶IV和核酸内切酶VIII的核酸内切酶。所述衔接子可包含核酸外切酶保护核苷酸，诸如含有硫代磷酸酯基团的核酸外切酶保护核苷酸。

在一些实施方案中，所述衔接子包含捕获部分的配体。例如，所述配体可以是生物素或修饰的生物素，并且所述捕获部分包含亲和素或链霉亲和素。所述配体可以是腺苷序列（寡-dA），并且所述捕获部分包含胸苷序列(寡-dT)。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括在测序之前例如使用靶特异性探针的靶富集步骤。

在一些实施方案中，本发明是制备用于分别对靶核酸的每条链进行测序的靶核酸的文库的方法，所述方法包括以下步骤：在反应混合物中，将双链靶核酸的末端接合至衔接子以形成双衔接的靶核酸，其中所述衔接子是形成双链茎和单链环的单链，并且所述茎包含链切割位点；使所述反应混合物与核酸外切酶接触，从而富集所述双衔接的靶核酸；使所述反应混合物与切割剂接触以在所述切割位点切割所述双衔接的靶核酸，在每条链上形成可延伸的末端。在一些实施方案中，本发明是确定样品中靶核酸的文库的序列的方法，所述方法包括以下步骤：如上所述形成靶核酸的文库；延伸所述可延伸的末端，从而分别对所述文库中的所述靶核酸的每条链进行测序，其中所述延伸终止于所述切割位点并且不进行到互补链上。

在一些实施方案中，本发明是分别对靶核酸的每条链进行测序的方法，该方法包括以下步骤：在反应混合物中，将双链靶核酸的末端接合至衔接子以形成双衔接的靶核酸，其中所述衔接子是形成双链茎和单链环的单链，并且所述环包含引物结合位点，并且所述衔接子进一步包含链合成终止位点，以及；使所述反应混合物与核酸外切酶接触，从而富集所述双衔接的靶核酸；使所述反应混合物与引物接触，所述引物能够与所述引物结合位点杂交；延伸所述引物，从而分别对所述靶核酸的每条链进行测序，其中延伸终止于所述链合成终止位点，并且不进行到互补链上。所述链合成终止位点可选自切口、缺口、无碱基核苷酸和非核苷酸接头。