[发明专利]用于鉴定病毒污染物的系统和方法

说明书

本公开涉及流线化的样品制备方法，即VERA(通过减少干扰物富集病毒)，使总基因组材料向病毒基因组倾斜。在样品采集后8小时内即可完成这种宿主基因组干扰物的减少。使用快速文库制备方案(约15分钟)和实时纳米孔测序，可以在样品采集后不到一个工作日内鉴定出潜在的病毒污染，例如RNA病毒污染。

技术领域

本发明整体涉及对细胞培养物中存在的核酸，尤其是病毒核酸序列进行测序的方法。

背景技术

下一代测序(NGS)平台和其他高通量测序(HTS)平台具有重新定义生物制药行业中的病毒安全性测试的潜力。尽管基于聚合酶链反应(PCR)的方法灵敏、便宜且快速，但基于NGS的方法允许对特定临床或生产样品中存在的所有病毒基因组进行广泛测试。一直以来，借助此技术作为生产过程中对潜在污染物进行系统性监视的工具受到外来物质的宏基因组检测所需的工作流程的阻碍。具体而言，采用NGS技术进行常规病毒筛选措施需要优化样品制备策略、流线化和自动化的文库制备以及时间敏感性的数据分析工作流程。

病毒基因组复杂而多样，其中RNA病毒使从头HTS工作流程中的适足文库制备尤其复杂。与可相对容易检测的微生物和支原体污染相比，病毒污染带来了严重威胁，因为某些病毒难以检测，还有受感染的细胞培养物缺乏有效的处理方法。

因此，需要用于检测和鉴定细胞培养物中的病毒污染的新方法。

发明内容

一个实施方案提供了一种流线化的样品制备方法，即VERA(通过减少干扰物(Artifact)富集病毒)，以使总基因组材料向病毒基因组倾斜。可在样品采集后8小时内完成这种宿主基因组材料的减少。使用快速文库制备方案(约15分钟)和实时纳米孔测序，可以在样品采集后不到一个工作日内鉴定出潜在的病毒污染。

图1是用于检测和鉴定细胞培养物样品中的病毒核酸的示例性方法的示意图。用于鉴定细胞培养物样品中的病毒核酸的方法包括裂解细胞培养物的样品中的真核细胞。可以使用机械裂解技术，诸如超声处理或均化来进行细胞裂解。裂解细胞的优选方法是常规的冻融技术。细胞培养物中的细胞一经裂解，即从样品中移除细胞碎片。可以使用常规技术移除细胞碎片，包括但不限于离心、大小过滤或它们的组合。样品中的大多数细胞碎片一经移除，即浓缩样品以产生渗余物。然后用核酸酶处理渗余物以消化真核生物核酸。因为病毒颗粒保护病毒核酸，所以核酸酶处理不会消化病毒核酸。在一个实施方案中，用、OmniCleave^TM和RiboShredder^TM的组合处理渗余物，以消化培养物中的宿主细胞DNA和RNA。用核酸酶处理后，从渗余物中提取病毒核酸。在无需扩增的情况下对病毒核酸进行测序，例如通过实时纳米孔测序，并且进行鉴定。在某些实施方案中，从测序获得的病毒读段多于从测序获得的细胞核酸读段。

在所公开的方法的另一个实施方案中，病毒读段为从测序获得的总读段的至少51％，或为从测序获得的总读段的50％至99％，或为从测序获得的总读段的至少80％、85％或90％。

一般而言，细胞培养物中的细胞是真核细胞，例如中国仓鼠卵巢细胞。在一些实施方案中，细胞分泌蛋白质药物产物。蛋白质药物产物可以是抗体或其抗原结合片段、融合蛋白或重组蛋白。

在某些实施方案中，病毒是RNA病毒、DNA病毒或它们的组合。病毒可以是单链的或双链的。可以检测的示例性病毒包括但不限于小鼠细小病毒(Minute virus of mice,MVM)、MSV1、P12/EMC、小鼠脑脊髓炎病毒(Mouse Encephalomyelitis virus)、小鼠腺病毒(Mouse Adenovirus)、乳酸脱氢酶病毒(LDV)、多瘤病毒、小鼠肝炎病毒(MHV)、仙台病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCM)、呼肠孤病毒3型、克氏大鼠病毒(Kilham rat virus)和Toolan氏H-1病毒(Toolan’s H-1 virus)。

附图说明