[发明专利]用于单分子测序的双链DNA模板的生成

权利要求书

1.对双链靶标核酸的每条链分开测序的方法，其包括以下步骤：

a) 在反应混合物中，将双链靶标核酸接合至衔接子以形成衔接的靶标核酸，其中所述衔接子包含较短的链和较长的链，它们退火在一起形成双链和单链区域，所述单链区域仅包含一条未配对的链，且其中所述单链区域包含引物结合位点；

b) 使引物退火至每个衔接子中的所述引物结合位点；

c) 延伸所述引物，由此对所述衔接的靶标核酸的每条链进行测序。

2.权利要求1的方法，其中所述衔接子包含至少一个条形码。

3.权利要求1的方法，其中所述衔接子在所述双链区域中包含至少一个修饰的核苷酸。

4.权利要求1的方法，其中所述修饰的核苷酸是5'-磷酸化的末端核苷酸。

5.权利要求1的方法，其中所述修饰的核苷酸修改所述衔接子的双链区域的解链温度。

6.权利要求1的方法，其进一步包括靶标富集步骤。

7.权利要求6的方法，其中所述富集是通过用靶标特异性引物扩增。

8.权利要求1的方法，其进一步包括在步骤b)之前，使所述反应混合物与选自糖基化酶和内切核酸酶的DNA损伤特异性切割剂接触，由此切割损伤的DNA。

9.权利要求1的方法，其中所述靶标核酸包含两个或更多个拷贝的所述靶标序列的串联体。

10.权利要求9的方法，其进一步包括从所述串联体的序列构建靶标核酸的共有序列的步骤。

11.从样品中的双链靶标核酸制备核酸文库的方法，所述方法包括：在反应混合物中，将所述双链靶标核酸接合至衔接子以形成衔接的靶标核酸，其中所述衔接子包含较短的链和较长的链，它们退火在一起形成双链和单链区域，其中所述单链区域仅包含一条单链，且其中所述单链区域包含引物结合位点。

12.测定样品中的靶标核酸文库的序列的方法，所述方法包括以下步骤：

a) 通过权利要求11的方法形成单链环状靶标核酸的文库；

b) 使引物退火至每个衔接的靶标核酸中的所述引物结合位点；

c) 延伸所述引物，由此对所述文库中的所述靶标核酸的每条链进行测序。

13.对双链靶标核酸进行测序的方法，其包括以下步骤：

a) 在反应混合物中，用一对靶标特异性引物扩增靶标核酸，由此形成扩增子；

b) 将所述扩增子接合至衔接子以形成衔接的靶标核酸，其中所述衔接子包含较短的链和较长的链，它们退火在一起形成双链和单链区域，其中所述单链区域仅包含一条单链，且其中所述单链区域包含引物结合位点；

c) 使测序引物退火至所述引物结合位点；

d) 延伸所述引物，由此对所述靶标核酸进行测序。

14.制备靶标核酸的文库的方法，其包括以下步骤：

a) 在反应混合物中，用一对靶标特异性引物扩增靶标核酸，由此形成扩增子；

b) 将所述扩增子接合至衔接子以形成衔接的靶标核酸，其中所述衔接子包含退火的较短的链和较长的链，其中所述单链区域仅包含一条单链且进一步包含引物结合位点。

15.测定样品中的靶标核酸文库的序列的方法，所述方法包括以下步骤：

a) 通过权利要求14的方法形成衔接的靶标核酸的文库；

b) 使引物退火至每个衔接的靶标核酸中的所述引物结合位点；

c) 延伸所述引物，由此对所述文库中的每个靶标核酸进行测序。