[发明专利]用于单分子测序的双链DNA模板的生成

说明书

本发明是一种新型核酸测序方法，其涉及制备含有线性的部分单链衔接子的双链靶标核酸的文库并测序。

发明领域

本发明涉及核酸分析领域，且更具体地，涉及制备用于核酸测序的模板。

发明背景

包括纳米孔测序的单分子核酸测序通常利用环形模板。参见美国专利号7,302,146和8,153,375。将线性核酸转化成环状形式用于扩增和随后的检测和定量，参见美国专利号RE44265。对于其中优选线性构象的长靶标分子，环状模板构型不是理想的。本发明是使用新型的衔接子设计产生线性靶标序列的文库并进行测序的方法。该方法具有以下详细描述的多个优点。

发明概述

在一个实施方案中，本发明是对双链靶标核酸的每条链分开测序的方法，其包括以下步骤：在反应混合物中，将双链靶标核酸接合至衔接子以形成衔接的靶标核酸，其中所述衔接子包含较短的链和较长的链，它们退火在一起形成双链和单链区域，所述单链区域仅包含一条未配对的链，且其中所述单链区域包含引物结合位点；使引物退火至每个衔接子中的所述引物结合位点；延伸所述引物，由此对所述衔接的靶标核酸的每条链进行测序。可以通过连接来接合至所述衔接子。所述衔接子可以包含至少一个条形码。所述衔接子可以在所述双链区域中包含至少一个修饰的核苷酸。所述修饰的核苷酸可以是5'-磷酸化的末端核苷酸、硫代磷酸酯基团或可以修改所述衔接子的双链区域的解链温度。在一些实施方案中，所述方法进一步包括靶标富集步骤，例如，通过经由与固相支持物结合的靶标特异性探针的捕获或通过用靶标特异性引物扩增。在一些实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤：使所述反应混合物与选自糖基化酶和内切核酸酶的DNA损伤特异性切割剂接触，由此切割损伤的DNA。在一些实施方案中，所述靶标核酸包含两个或更多个拷贝的所述靶标序列的串联体。在一些实施方案中，所述方法进一步包括从所述串联体的序列构建靶标核酸的共有序列的步骤。

在另一个实施方案中，本发明是从样品中的双链靶标核酸制备核酸文库的方法，所述方法包括：在反应混合物中，将所述双链靶标核酸接合至衔接子以形成衔接的靶标核酸，其中所述衔接子包含较短的链和较长的链，它们退火在一起形成双链和单链区域，其中所述单链区域仅包含一条单链，且其中所述单链区域包含引物结合位点。

在又另一个实施方案中，本发明是测定样品中的靶标核酸文库的序列的方法，所述方法包括以下步骤：形成如前述段落中所述的单链环状靶标核酸的文库；使引物退火至每个衔接的靶标核酸中的所述引物结合位点，延伸所述引物，由此对所述文库中的所述靶标核酸的每条链进行测序。

在又另一个实施方案中，本发明是对双链靶标核酸进行测序的方法，其包括以下步骤：在反应混合物中，用一对靶标特异性引物扩增靶标核酸，由此形成扩增子；将所述扩增子接合至衔接子以形成衔接的靶标核酸，其中所述衔接子包含较短的链和较长的链，它们退火在一起形成双链和单链区域，其中所述单链区域仅包含一条单链，且其中所述单链区域包含引物结合位点；使测序引物退火至所述引物结合位点；延伸所述引物，由此对所述靶标核酸进行测序。

在又另一个实施方案中，本发明是制备靶标核酸的文库的方法，其包括以下步骤：在反应混合物中，用一对靶标特异性引物扩增靶标核酸，由此形成扩增子；将所述扩增子接合至衔接子以形成衔接的靶标核酸，其中所述衔接子包含退火的较短的链和较长的链，其中所述单链区域仅包含一条单链且进一步包含引物结合位点。

在又另一个实施方案中，本发明是测定样品中的靶标核酸文库的序列的方法，所述方法包括以下步骤：形成如前述段落中所述的衔接的靶标核酸的文库；使引物退火至每个衔接的靶标核酸中的所述引物结合位点；延伸所述引物，由此对所述文库中的每个靶标核酸进行测序。

附图简述

图1举例说明新型衔接子，也由Seq. Id. No:1 +2代表。

图2举例说明用图1中显示的衔接子对单个长靶标序列进行测序的方法。