[发明专利]抗体亲和力成熟的方法

说明书

本发明涉及一种产生编码目标抗体的框架区和至少一个相邻互补性决定区（CDR）的多核苷酸的文库的新颖方法。这些文库适合用于亲和力成熟程序，以便获得与亲本抗体相比具有改进特性的成熟抗体。

本发明涉及一种产生编码目标抗体的框架区和至少一个相邻互补性决定区（CDR）的多核苷酸的文库的新颖方法。这些文库适合用于亲和力成熟程序，以便获得与亲本抗体相比具有改善特性的成熟抗体。

在本说明书中，引用了许多文件，包括专利申请和生产商的手册。这些文件的公开内容尽管不被认为与本发明的专利性有关，但是一并通过引用整体并入。更具体地，所有参考文件通过引用并入，达到如同明确地且单独地指出每篇单独文件通过引用并入相同的程度。

抗体被广泛用于诊断和治疗应用。这已经导致在开发用于优化此类抗体的性质（例如增加对靶抗原的亲和力）的程序方面的巨大努力。由于在降低的抗体和/或抗原浓度下改善的特异性，预期增加抗体的亲和力会增强抗体的性能。已知用于体外亲和力成熟的不同方法，包括基于细胞的展示，例如酵母细胞表面展示、噬菌体展示或无细胞展示（诸如核糖体展示）。这些方法允许进行阴性和阳性选择，以消除非特异性结合剂并以高亲和力鉴定特异性结合剂。

但是，已知的亲和力成熟方法的一个缺点是大量未诱变的亲本序列在多核苷酸文库中的频繁发生，这使得改善的抗体的选择和鉴定既费时又费力。在某些情况下，甚至不可能通过亲和力成熟程序鉴定改善的抗体。本发明的发明人现在已发现一种通过提供不包含不希望的大量亲本序列的文库来克服与现有技术有关的缺点的方法。

本发明以针对心肌肌钙蛋白T (cTnT)的抗体为例，但是考虑到该方法可以转移到针对其它抗原的抗体。

心肌肌钙蛋白T是在心脏病患者中广泛使用的生物标志物。Westermann等人最近已经综述了它在心脏病患者中的效用。(Nature Reviews / Cardiology, vol 14 (2017)473-483。在怀疑患有急性心肌梗塞(AMI)的患者中，cTnT的使用已得到很好的确立，但是肌钙蛋白测量也用于其它急性和非急性场合。对于具有疑似AMI的患者，早期决策对于快速治疗和进一步诊断评价是至关重要的。

肌钙蛋白的更新高灵敏度测定法能够检测明显更低的浓度。使用这些测定法和非常低的截止浓度，已经报道了几种快速诊断策略会改善急性心脏护理中的诊断。此外，肌钙蛋白测定的非冠脉和非急性应用（例如作为具有心力衰竭、肺栓塞或稳定冠状动脉疾病的患者中的生物标志物）即将出现，并可能改善个体风险分级。

通常在夹心型免疫测定法中测量心肌肌钙蛋白T，其中至少一种抗体用于捕获cTnT，且至少第二种（经标记的）抗体用于检测样品中的cTnT。德国Roche Diagnostics公司出售的cTnT的第五代测定也是如此。由欧洲动物细胞培养物保藏中心（GB）保藏的杂交瘤克隆7.1 A 12.2-22 (ECACC 89060901)所产生的单克隆抗体12.1A11.11-7自从将近三十年来一直在cTnT的测定中被用作最佳检测抗体。自从该抗体于1989年产生以来，没有出现用于检测cTnT的更好的单克隆抗体。

在过去的几年中，已经开发了用于测量各种肌钙蛋白的更灵敏的测定法，例如基于标记在此类测定中使用的检测抗体的先进技术。

许多研究已经评价了肌钙蛋白的各种高灵敏度测定，这是由于它们改善对疑似AMI患者的分诊的潜力以及它们在临床诊断的其它领域中的实用性。

已经报道，即使最灵敏的肌钙蛋白测定也无法在一定百分比的健康个体中测量肌钙蛋白(参见例如Westermann等人, 以上)。显而易见，测定灵敏度是最重要的，例如在cTnT的检测中，并且为此目的的改善将是非常合乎需要的。