[发明专利]葡萄球菌属细菌的营养缺陷型菌株

说明书

本公开内容提供了依赖于D‑丙氨酸用于生长的重组葡萄球菌属细菌(例如表皮葡萄球菌)。在一个方面，本公开内容的特点在于重组葡萄球菌属细菌，其包含两个失活的丙氨酸消旋酶基因(Δalr1Δalr2)；以及失活的D‑丙氨酸转氨酶(dat)基因。在另一个方面，本公开内容的特点在于制备重组葡萄球菌属细菌的方法。

相关申请

本申请要求于2018年1月5日提交的美国临时专利申请号62/614,096的优先权，所述美国临时专利申请的全部内容整体引入本文作为参考用于所有目的。

发明背景

许多细菌在肽聚糖层的生物合成中利用了两种氨基酸D-丙氨酸和D-谷氨酸，所述肽聚糖层对于在此类细菌中构建功能细胞壁是必需的。革兰氏阳性细菌，包括葡萄球菌属(Staphylococcus genus)中的物种，利用D-丙氨酸和D-谷氨酸用于合成在其细胞壁中的肽聚糖层。

遗传密码提供了20种蛋白原性氨基酸的密码子，其中19种具有手性，并且是L-异构体。这些被视为“天然”或“标准”氨基酸。具有相反手性，即D-异构体的氨基酸，被视为非天然的，并且一般不存在于环境中。如果生物如细菌需要D-氨基酸，则产生此类非天然氨基酸的一种或多种酶必须存在于细菌中，或者必须有意提供给细菌，否则它不能存活。

丙氨酸消旋酶是催化L-丙氨酸至D-丙氨酸的转换的酶，D-丙氨酸是细菌细胞壁中的肽聚糖层生物合成的关键构件块。丙氨酸消旋酶通常在真核生物中不存在，但在原核生物中普遍存在。

由于D-丙氨酸对于细菌细胞壁的形成并且因此对于细菌的存活是必需的，因此细菌具有可以催化D-丙氨酸产生的酶。由于D-丙氨酸对细菌的生存是非常重要的，因此它可能具有用于D-丙氨酸生物合成的冗余或多种酶。例如，细菌可以含有多个丙氨酸消旋酶基因。在具有两个基因的物种中，一个可以是组成性表达和合成代谢的，而另一个是可诱导和分解代谢的(Strych，U.等人2007. BMC Microbiol. 7:40；Strych U.等人，Curr.Microbiol. 41:290-294；Strych U.等人，FEMS Microbiol. Lett. 196:93-98)。这些基因供应了对于细胞壁生物合成所需的D-丙氨酸，并且用这些细菌中的几种的敲除研究已确定，丙氨酸消旋酶对于在不存在外源D-丙氨酸的情况下的生长是必需的(Franklin，F. C.和W. A. Venables. 1976. Mol. Gen. Genet. 149:229-237；Hols，P.等人J. Bacteriol.179:3804-3807；Palumbo，E.等人FEMS Microbiol. Lett. 233:131-138；Steen，A.等人J.Bacteriol. 187:114-124；Wijsman，H. J. 1972. Genet. Res. 20:269-277)。

去除微生物产生对于生长所需的氨基酸的能力产生称为营养缺陷体的微生物。如果需要微生物的存活和生长，则必须外源提供对于生长所需的氨基酸。营养缺陷型微生物的产生是众所周知的，尤其是对于大肠杆菌(E. coli)。(可在万维网上cgsc2.biology.yale.edu/Auxotrophs.php处公开获得；Methods Enzymol. 2015；565:45-66. doi: 10.1016/bs.mie.2015.05.012. Epub 2015 Jun 10. “Escherichia coliauxotroph host strains for amino acid-selective isotope labeling ofrecombinant proteins.” Lin MT，Fukazawa R，Miyajima-Nakano Y，Matsushita S，ChoiSK，Iwasaki T，Gennis RB； Nicola Casali，Methods in Molecular Biology，第235卷.www.springer.com/gp/book/9781588291516，各自的内容整体引入本文作为参考)。